2019 Fiscal Year Annual Research Report
微小管構築に必須な進化上保存された新規経路の空間・時間的制御機構
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16H02503
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
登田 隆 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 特任教授 (50197894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湯川 格史 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 助教 (50403605)
西 晶子 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (50772422) [Withdrawn]
上野 勝 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (90293597)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 微小管 / 双極性紡錘体 / 中心体 / キネシンモーター / 分裂酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
α/β-チューブリンヘテロ二量体が重合して形成される微小管は、生物個体の発生過程に応じて細胞内で様々な形態をとり、細胞分化に重要な役割を持つ。例えば神経細胞におけるニューロン、臓器細胞における繊毛、精子細胞における鞭毛などである。一方、細胞分裂・増殖過程においては、微小管は双極性紡錘体を形成することによって染色体の均等分配に必須機能をもつ。染色体分配に異常をきたすと、細胞死、流産あるいは癌化が引き起こされる。双極性紡錘体は中心体（酵母ではスピンドル極体、Spindle Pole Body, SPB）と呼ばれる構造体から重合、形成される。正常な双極性紡錘体形成には重合した微小管の末端が中心体と結合し、つなぎとめられる（繋留、アンカー）必要がある。しかしそのメカニズムは不明である。本研究課題は微小管の中心体繋留を可能にする分子機構とその制御経路を解明することを課題とする。
平成31/令和元年度は、前年度に引き続き、分裂酵母を用いて次のプログラムを遂行し、それぞれ成果を上げることができた。(1) 微小管繋留（アンカー）と競合的に機能する5型キネシンをコードするcut7遺伝子の温度感受性変異体を網羅的に分離する方法を開発した。 (2) 6型キネシンKlp9 が微小管上をプラス端方向に動くモータータンパク質であることを、生化学的・生物物理学的に証明した。(3) 5型キネシンCut7と6型キネシンKlp9が協調的に機能することによって、M期後期のスピンドル伸長が遂行されることを世界で初めて示した。(4)微小管ポリメラーゼAlp14とDis1が遺伝子重複により生じた単なる相同タンパク質ではなく、その役割は機能的に異なることを証明した。(5)ヒト１４型キネシンHSETを分裂酵母細胞で発現させ、その細胞株を用いて植物（セイタカアワダチソウ）からHSET阻害剤小分子を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度【今後の研究の推進方策】として、次の３つの研究計画を挙げた (1)5型キネシンCut7の温度感受性変異サプレッサー遺伝子の包括的解析。(2)Cut7がスピンドル微小管安定性を制御する機作の解明。(3)酵母-ヒト間のキネシン分子の機能保存検証。以下、それぞれの計画の進捗状況を記述する。(1)については、Cut7の温度感受性変異体を新たに分離し（Tang et al., 2019, Biosci Biotechnol Biochem; Yukawa et al., 2019, Sci Rep）、それらを用いて、サプレッサー遺伝子との機能相関を検討した。その結果、サプレッサー遺伝子が3つのグループに分類できることが明らかになり、サプレッサー遺伝子産物の細胞機能に関して新知見を得ることができた。(2)については、Cut7が6型キネシンKlp9と協働して、微小管安定性を制御することを見出した（Yukawa et al., 2019, Sci Rep）。さらに微小管ポリメラーゼAlp14、Dis1分子も微小管伸長・安定性に重要な機能を持つことも明らかになった（Yukawa et al., 2019, Int J Mol Sci）。(3)については、4つのヒトキネシン遺伝子を分裂酵母で発現させ、キネシン分子の酵母とヒト間での機能保存の検証実験が進行中である。論文出版は、上にも一部挙げたが、国際誌に4報（Tang et al., 2019, Biosci Biotechnol Biochem; Yukawa et al., 2019, Sci Rep; Yukawa et al., 2019, Int J Mol Sci; Kurisawa et al., 2020, Bioorg Med Chem）出版した。以上の成果から、今年度の本事業は『概ね順調に進行している』と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)5型キネシンcut7温度感受性変異を抑圧する新規サプレッサー遺伝子の機能解析。 単離したサプレッサー遺伝子のうち、2遺伝子（skf7, skf8）が新規RNA結合タンパク質をコードすることが明らかになった。興味深いことに、Skf7タンパク質は通常は細胞質内に均一に存在するが、種々の細胞ストレス条件下で、細胞内で多数の凝集顆粒を形成した。さらにこの顆粒がストレス顆粒（Stress Granules, SGs）であることも判明した。令和2年度はSkf7を含むSGsの細胞周期における機能、SGsと微小管繋留経路の機能連関について、鋭意解析する予定である。一方、Skf8は通常は細胞核内、特に染色体上にドット状局在を示す。RNAseq法を用いて、Skf8と結合するRNA分子の同定、Skf8のRNA代謝における役割解明を目指す。(2)ヒトキネシン分子(KifC3、Eg5)機能の酵母を利用した解析。酵母とヒトキネシン分子の機能保存性を調べる過程で、14型キネシンHSETのみならず、他2つのヒトキネシン分子(KifC3、Eg5)を分裂酵母内で過剰発現させると、致死となることが明らかになった。多くのヒト癌細胞でKifC3、Eg5の過剰発現あるいは活性異常が報告されている。分裂酵母系をモデルとして、これらキネシン分子による癌化の原因を追求したい。具体的には、生細胞ライブ観察によるキネシン過剰発現細胞の詳細な表現型観察及びサプレッサー変異単離とその遺伝子同定である。(3)ヒトキネシン阻害剤の酵母を用いた分離と同定。前年度HSET阻害剤としてセイタカアワダチソウからコラヴェン酸アナログ体を同定した。今年度は植物のみならず、植物に共生する放線菌にも着目し、新たな阻害剤の分離を目指す。またHSET以外のキネシン、特にKifC3、Eg5の阻害剤分離にも着手する。
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