2016 Fiscal Year Annual Research Report
リグニン認識機能を賦与した人工酵素触媒の合成によるバイオマス分解新戦略
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16H02560
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
渡邊 隆司 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (80201200)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
入江 俊一 滋賀県立大学, 環境科学部, 准教授 (30336721)
磯崎 勝弘 京都大学, 化学研究所, 助教 (30455274)
西村 裕志 京都大学, 生存圏研究所, 助教 (50553989)
片平 正人 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | リグニン / 酵素 / セルラーゼ / バイオマス / ペプチド / ナノ触媒 / NMR / バイオリファイナリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
15Nでラベルした糸状菌Trichoderma reeseiのセロビオヒドロラーゼ（Cel7A）のCBM1を大腸菌で発現し、精製した。発現したタンパクは、電気泳動、MALDI-TOF-MS、二次元NMRで構造を解析した。培養条件により、フォールディングに差がでることをNMRで見出し、正常ホールディングする実験条件を確立した。15Nでラベル化CBM1にセロヘキサオースおよび分離したリグニンを加えてNMRを測定し、結合するアミノ酸を解析した。その結果、リグニンでは、セロヘキサオースに比較して、疎水性のトリプレットアミノ酸のみならず、多くの部位でCBM1に結合することを明らかにした。また、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporiumが生産する主要LiPアイソザイム H8（LiP A）のC末端にT. reesei cel7Aリンカー領域およびCBM領域を付加した組換えタンパク質をコードする遺伝子を作成し、LiPを生産しない白色腐朽菌ヒラタケへ導入した。また、リグニン吸着性の増加が見込まれるアミノ酸置換を行ったCBM領域についても同様の操作を行った。現在、組換えLiPの諸性質解析、および組換えLiPを生産する組換えヒラタケの木質分解性試験を実施している。
さらに、リグニン親和性ペプチドリガンドを有する磁性金属微粒子人工酵素触媒の開発を行った。リグニン認識ペプチドリガンドへのリガンド交換の可能なステアリン酸で保護されたマグネタイトナノ粒子を合成し、マイクロ波照射下における触媒的酸化特性について評価した。種々の酸化反応の検討の結果、マグネタイトナノ粒子は過酸化水素存在下、マイクロ波照射により、収率は中程度ながらわずか数分程度で速やかにベンジルアルコールの酸化反応を促進することを見出した。現在、リグニンダイマーモデルに対する反応性解析を実施している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
15Nラベル化した糸状菌Trichoderma reeseiのセロビオヒドロラーゼ（Cel7A）のCBM1の発現と精製し、リグニンとの相互作用を高分解能二次元NNMRで解析することに成功し、さらにタンパクのフォールディングに及ぼす培養条件の影響を明らかにした。本結果は、セルラーゼの様々なアミノ酸とリグニンの相互作用を分子レベルで解析した初めての例であり、関連研究分野に大きな影響を与えると判断した。当該研究を発表した修士課程学生は、学会の優秀ポスター賞を受賞した。今後、解析を継続することにより、これまで未解明であったセルラーゼを構成するアミノ酸とリグニンの分子間相互作用が詳細に解明されると期待される。また、白色腐朽菌P. chrysosporiumのLiPアイソザイムにT. reesei cel7Aリンカー領域およびCBM領域を付加した組換えタンパク質をコードする遺伝子を作成し、白色腐朽菌ヒラタケへの導入発現に成功した。このように、28年度においてリグニン分解酵素にCBMを融合したタンパクを白色腐朽菌で発現する実験系の構築に成功した。さらに、磁性金属微粒子人工酵素触媒を合成し、マイクロ波照射により高いベンジルアルコールの酸化能をもつことを明らかにした。以上の結果から、リグニン親和性タンパクやペプチドを分子ツールとしてもちいる（人工）酵素触媒の開発と機能解析の基盤が構築され、大きな研究の壁を突破したと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
15Nラベル化した糸状菌Trichoderma reeseiのセロビオヒドロラーゼ（Cel7A）のCBM1の発現と精製に成功したため、研究を発展させる基盤が確立した。今後は、CBMとしてCel7AのCBM1とリグニンとの相互作用の解析に注力し、部位特異的改変も組み合わせて、リグニン・タンパク間の相互作用の詳細を明らかにする。リグニン側の結合部位についても情報を得るため、リグニンオリゴマーを有機合成して、結合性を解析する。また、白色腐朽菌P. chrysosporiumのLiPアイソザイムにT. reesei cel7Aリンカー領域およびCBM領域を付加した組換えタンパク質を白色腐朽菌ヒラタケで発現する実験系の構築に成功したことから、融合タンパクの性質解明と、形質転換したヒラタケの木材腐朽特性を詳細に解析する。また、リグニン親和性ペプチドを結合した磁性金属微粒子人工酵素触媒を合成し、本触媒のリグニンモデルや単離リグニンに対する反応性と、マイクロ波効果について詳細な解析を進める。
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[Journal Article] A development and an improvement of selectable markers in Pleurotus ostreatus transformation.2017
Author(s)
Matsunaga, Y., Ando, M., Izumitsu, K., Suzuki, K., Honda, Y., Irie, T.
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Journal Title
Journal of Microbiological Methods
Volume: 134
Pages: 27-29
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Analysis of molecular interaction of peptides with lignin for lignocellulosic biorefinery2016
Author(s)
T. Watanabe, A. Yamaguchi, S. Oshiro, T. Suetomi, H. Nishimura, T. Nagata, T. Mashima, M. Katahira, K. Isozaki, H. Takaya, M. Nakamura
Organizer
LignoBiotech IV - 4th Symposium on Biotechnology applied to Lignocelluloses
Place of Presentation
マドリッド
Year and Date
2016-06-21 – 2016-06-21
Int'l Joint Research
