2017 Fiscal Year Annual Research Report
Synthetic regulatory mechanism and physiological function of nitric oxidce in yeasts and fungi in
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16H02601
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 博史 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡辺 大輔 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30527148)
知花 博治 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (30333488)
川本 進 千葉大学, 真菌医学研究センター, 客員教授 (80125921)
萩原 大祐 千葉大学, 真菌医学研究センター, 特任助教 (20612203)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵母 / 一酸化窒素 / 酸化ストレス / シグナル伝達 / 病原真菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）酵母におけるNOの合成機構とその制御機構：酵母のNO合成に関与するジフラビンタンパク質Tah18は酵母から哺乳類まで広く保存されている。そこで、Tah18の代わりに哺乳類のホモログであるNdor1を発現する酵母を作製し、Tah18依存的にNO合成を行う過酸化水素処理条件下での細胞内NO量を測定した。その結果、Tah18の機能欠損株は、野生型株と比較して顕著なNO合成量の低下を示したが、Tah18-Ndor1置換株は、野生型株と同程度のNO合成量を示した。この結果から、Ndor1は酵母で見出した新規なNO合成機構に関与する機能を有しており、哺乳類にも同様の機構が存在する可能性が示された。
２）酵母におけるNOおよびNO標的タンパク質の生理機能：対数増殖期まで培養した酵母から抽出したタンパク質溶液に、NOドナーのS-ニトロソグルタチオン（GSNO）を添加し、S-ニトロソ（SNO）化システインを特異的にビオチン化するビオチンスイッチ（BS）法に供した。BS処理後、抗ビオチン抗体を用いたウェスタンブロット法によりビオチン化タンパク質の検出を行った。その結果、GSNO処理によってビオチン化タンパク質のレベルが顕著に上昇した。アビジン結合ビーズを用いたプルダウンアッセイによる溶出画分においても、GSNO処理条件に特異的に出現する複数のバンドを検出した。
３）病原真菌におけるNOの合成制御機構と生理機能：糸状菌のNO応答を明らかにするために、トランスクリプトーム解析を行った。その結果、NOドナー添加1時間後に複数の二次代謝遺伝子クラスターの発現が変動することが明らかになった。また、臨床で分離された複数のAspergillus fumgiatus株のNO感受性を評価したところ、超感受性を示す株が見つかり、株間でNO応答に多様性があることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
酵母におけるNOの合成機構とその制御機構の解析については。Dre2がTah18依存的なNO合成を阻害すること、酸化ストレスに応答して、Dre2がTah18から解離することを見出し、Dre2が酸化ストレスセンサーとして働き、NO合成を制御する機構を提唱した。また、NOは高温ストレス耐性に寄与する一方で、高濃度の過酸化水素存在下で細胞死を誘導することから、二面性（細胞保護・細胞毒性）が示唆された。さらに、Tah18の哺乳類オルソログNdor1が酵母のNO合成に関与することを見出し、新規なNO合成機構が真核生物に広く保存されている可能性を示した。一方で、酵母におけるNOおよびNO標的タンパク質の生理機能の解析については、細胞内のニトロソ化タンパク質の探索、同定に必要な実験手法（ビオチンスイッチ法）の確立が予想以上に難航していたが、今年度にほぼ実験方法を確立することができ、NO処理後に特異的に検出されるタンパク質を多数同定した。また、病原真菌におけるNOの合成制御機構と生理機能の解析については、Aspergillus fumigatusの臨床株の中に、NO量またはNO耐性の低いものが存在し、NOと病原性との関連が強く示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）酵母におけるNOの合成機構とその制御機構：酵母のオキシゲナーゼ様タンパク質を同定し、NO合成における分子機能を解析する。また、酵母を用いてカスパーゼ依存的な細胞死の分子機構や生理的意義に対する理解を深める。さらに、Tah18依存的なNO合成機構およびその普遍性の解明を目的に、Tah18の哺乳類ホモログNdor1、Dre2の哺乳類ホモログCiapinに着目し、Tah18-Dre2と同様にNO合成やその制御に関与しているかどうかを解析する。
２）酵母におけるNOおよびNO標的タンパク質の生理機能：様々な条件で培養・処理した細胞を調製し、BS法を用いたスクリーニング系によってSNO化タンパク質を同定するとともに、これらの機能解析を行い、酵母におけるタンパク質のSNO化を介したNOの生理的役割を明らかにする。
３）病原真菌におけるNOの合成制御機構と生理機能：NO関連遺伝子の変異株を用いて、細胞内NOが及ぼす影響とその制御機構を解析する。NO応答として二次代謝が変動する現象については、産生物質の分析と応答分子機構の解析を行う。
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