2018 Fiscal Year Annual Research Report
Synthetic regulatory mechanism and physiological function of nitric oxidce in yeasts and fungi in
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16H02601
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
高木 博史 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
那須野 亮 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (90708116)
渡辺 大輔 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30527148)
川本 進 千葉大学, 真菌医学研究センター, 客員教授 (80125921)
萩原 大祐 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (20612203)
知花 博治 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (30333488)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵母 / 一酸化窒素 / 酸化ストレス / シグナル伝達 / 病原真菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）酵母におけるNOの合成機構とその制御機構：酵母におけるNO合成にNADPHが必要であるかは明らかでない。そこで、NADPH代謝関連酵素の遺伝子破壊株を作製し、NO特異的な蛍光プローブDiaminofluorescein-FM diacetate（DAF-FM DA）およびフローサイトメーターを用いてNO合成に与える影響を評価した。その結果、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼGnd1をコードする遺伝子（GND1）の破壊株において、過酸化水素処理条件下でのNO合成量が顕著に低下した。また、プラスミドを用いた遺伝子の相補実験の結果からも、Gnd1依存的にNOが合成されることが明らかになった。従って、酵母のNO合成において、ペントースリン酸回路を介して合成されるNADPHが必要である可能性が示された。
２）酵母におけるNOおよびNO標的タンパク質の生理機能：ビオチンスイッチ（BS）法および液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS/MS）を用いて、S-ニトロソ（SNO）化されるタンパク質を同定した。酵母の細胞から抽出したタンパク質溶液をS-ニトロソグルタチオン（GSNO）で処理し、BS法に供した後、抗ビオチン抗体を用いたウェスタンブロットを行った。続いて、アビジン結合樹脂を用いたプルダウンにより濃縮したビオチン化タンパク質をLC-MS/MSに供し、SNO化タンパク質候補を多数同定した。これらの中には、解糖系やTCA回路の酵素が多く含まれ、SNO化修飾により炭素代謝が制御されることが示唆された。
３）病原真菌におけるNOの合成制御機構と生理機能：Aspergillus fumigatusにおいて、ストレスがNO産生を誘導するかどうか検討した。その結果、高温または過酸化水素処理によって、DAF-FM DA由来の蛍光シグナルが検出され、菌糸内でNOが発生することが示された。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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