2017 Fiscal Year Annual Research Report
痛み治療のための再生医療の開発：細胞移植技術と徐放製剤を活用した新規アプローチ
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16H02678
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
齋藤 繁 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (40251110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荻野 祐一 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (20420094)
高澤 知規 群馬大学, 医学部附属病院, 講師 (30400766)
田畑 泰彦 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (50211371)
須藤 貴史 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60739621)
久保 和宏 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (80546531)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 慢性疼痛 / 再生医療 / 抑制ニューロン / 脊髄後角 / 神経障害性疼痛 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年の研究では中枢神経系のペインマトリックスを構成する脳部位、感情面からの疼痛認知修飾部位をfMRIなどで明らかにすることで、多様な実験手法を用いた慢性疼痛治療開発を試みた。特に、下行性抑制メカニズムの解明を行う中で、動物実験において三環系抗うつ薬が末梢神経障害後の痛み誘発性鎮痛の減弱を回復させることが確認された。大脳皮質から脊髄後角への局所抑制回路では、脊髄後角I層およびII層外側のGABA系統が重要であるが、II層内側より深部ではグリシンが重要であると報告しているものを再確認した上で、神経障害性疼痛のモデル動物の脊髄、青斑核、その投射系の細胞活動について前年度に引き続き生理学的、形態学的、薬理学的に検証した。
行動実験：疼痛閾値の測定では、様々な薬剤を投与した上で、Paw-pressureテストを用いラットおよびマウスの実験を行った。機械的侵害刺激を動物の後肢に与え、逃避した時の圧を逃避閾値として算出した。正常ラットの逃避閾値は200g程度であるが、SNLラットでは神経切断後100g前後まで低下する。この実験では、SNLラットの機械的痛覚過敏が薬理学的介入によってどの程度改善するかを観察した。遺伝子改変マウスでの実験につなげる基礎データを得ている。遺伝子改変動物による実験を計画している。
さらに、形態学的検証では、薬理学的前処置後、4％PFAにてラットを潅流固定し、脊髄を取り出して形態観察用の切片を作成した。この実験は前年度から継続的に行っている青斑核の投射経路の検索であり、本年度は特に、脊髄後角の抑制性介在ニューロンは主に頭尾側方向に神経突起を伸ばすことの確認作業を行った。厚さ40 μmの矢状断切片を作成し、この切片から共焦点顕微鏡による連続的な写真撮影を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究では、中脳水道周辺灰白質、RVM、青斑核に関する先行研究の結果を踏まえ、神経投射路の活性化により疼痛が減弱するとの結果に関して知見を得る事ができた。特に青斑核からの投射路の不活化モデルを作成し、下行性抑制系のメカニズムに関して、これまでの実験結果と整合性を取るための追加の実験を行っている。本年の研究においては多様なな実験手法を用いた多角的なアプローチを行った結果、このメカニズムの一端が解明できた。特に、当初から関心のある脊髄後角の局所抑制回路に関して、I層およびII層外側ではGABAが重要であるが、II層内側より深部ではグリシンが重要であると報告したものが再確認でき、ノルアドレナリン系やアセチルコリン系との連携に関しても神経障害性疼痛のモデル動物の脊髄、青斑核、その投射系の細胞活動について薬理学的な検証を続けている。
慢性痛の臨床例に準じた薬剤投与の例として、Paw-pressureテストの実験において、機械的侵害刺激を動物の後肢に与え、逃避した時の圧を逃避閾値として算出することができた。その結果は、正常ラットの逃避閾値は200g程度であるところ、SNLラットでは神経切断後100g前後まで低下するというものであり、この実験でも、SNLラットの機械的痛覚過敏が薬理学的介入によってどの程度改善するかを観察することができた。これは前年、前々年の研究成果と整合するものであったが、形態学的な検証を深めることでデータの信頼度を増強した。
本年の各種の実験により、末梢神経障害性の痛みでは下行性制御系の活動が重要である事が再確認されたことは痛みメカニズムの解明に寄与したと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
遺伝子改変動物の使用により、これまでの実験モデル成果に関してより厳密な解析を進めている。従来モデルでは、より一層精度を高め、活動しているニューロンが実際に抑制性介在ニューロンとしての機能を発揮しているかどうかを調べる予定である。あわせて、脊髄は海馬や小脳等の中枢神経と異なり、神経回路網や個々のニューロンの役割については未解明な部分が多いので、再度
電気生理学的手法を用いて、マウスを用いた先行研究では調べられていない次の二つのことを明らかにする予定である。
疼痛再現が可能なモデルにおいて、移植したニューロンが実際にGABAを放出して、周囲のニューロンの興奮を抑制していることを確認する。蛍光顕微鏡下にVenusを発現するニューロンの周囲のニューロンを対象としてパッチクランプを完成させる予定である。そして、Venusを発現しているニューロンの細胞体に刺激電極をあて、活動電位を発生させる。更にパッチランプ記録を行っているニューロンから抑制性シナプス後電流(IPSC)が観察され、それがGABA受容体の拮抗薬であるbicuculline(10 μM)によって消失すれば、記録しているニューロンが移植したニューロンからGABA作動性の入力を受けていることが確認できる。
GABA作動性の入力が移植したニューロンからの直接的な入力、つまりmonosynapticな入力であることを確認するために、高頻度刺激を行ってfailureが見られるかどうかでmonosynapticな入力とpolysynapticな入力を区別する。移植したニューロンがどのような情報を皮膚から受け取っているか（Aβ繊維を介する触の情報なのか、あるいはAδやC繊維を介する痛みの情報なのか）を調べるために、脊髄後根付きスライス標本を作製する。In-vivo patchの適用も検討している。
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[Journal Article] Sustained-release lidocaine sheet for pain following tooth extraction: A randomized, single-blind, dose-response, controlled, clinical study of efficacy and safety.2018
Author(s)
Suzuki T, Kosugi K, Suto T, Tobe M, Tabata Y, Yokoo S, Saito S.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 13
Pages: -
DOI
Open Access
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