Toxicological assessment of organohalogen contaminants in cat (Felis catus) omics approach

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H02989
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 野見山 桂 愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 准教授 (30512686)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水川 葉月 北海道大学, 獣医学研究科, 助教 (60612661) ; 国末 達也 愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 教授 (90380287)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ネコ / PCBs / 代謝 / OH-PCBs / メタボロミクス / 酸化ストレス / 甲状腺ホルモン

Outline of Annual Research Achievements

本年度はイエネコのin vivo PCBs曝露試験を実施してPCBsとOH-PCBsの体内動態を解析するとともに、甲状腺ホルモン濃度および血清中のメタボロームを分析することでPCBs曝露に伴う生体内変化を検証した。
イエネコへ曝露試験は曝露群（オスn= 4）にPCBs 12異性体(各異性体: 0.5 mg/kg)、対照群（オスn= 4）にはコーン油を腹腔内投与し、曝露後は経時時間毎に血清を採取し分析した。
PCBs曝露群ではアミノ酸、アミン等を含む122種のメタボロームが有意な変動を示した。これらメタボロームのパスウェイを解析した結果、糖分解・糖新生、ペントースリン酸回路、ヒスチジン代謝系、プリン代謝系等の中心炭素代謝に関連するメタボロームが減少しており、PCBs・OH-PCBs曝露に伴うこれらの代謝経路の抑制が示唆された。
変動の見られたメタボロームと血清中PCBs・OH-PCBs濃度との相関をMaximal Information Coefficient (MIC)を用いて解析した結果、PCBsでは20種、OH-PCBsでは19種の代謝物で寄与率が >0.4を示した。とくに寄与率の高かったメタボロームに注目すると、抗酸化物質である酸化型グルタチオン（GSSG）がPCBs濃度と高い寄与率を示し、OH-PCBs濃度に対してはペントースリン酸経路に関わるSedoheptulose 1,7-bisphosphate(SBP)が高い寄与率を示した。また、GSH、GSSG共に曝露群で有意に減少していたことから、PCBs曝露により酸化ストレスが増大し、中心炭素代謝も抑制された結果、GSSGからGSHへの還元能力が低下するとともに、グルタチオン自体の生産量も低下したことが推察された。
血清中甲状腺ホルモン濃度を分析した結果、曝露群とコントロールで有意差は見られなかった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

２８年度の研究計画では、ネコのin vivo PCBｓ曝露試験を実施し、1) 体内分布と蓄積特性の解明、2) 血清および臓器中メタボロームの解析、3)甲状腺ホルモンの分析と影響評価の課題を計画していたが、これら概ね予定していた研究を実施することができ、PCBs曝露によるCYPsを介した酸化ストレスの発現と中心炭素代謝への抑制影響を明らかにすることができた。

その一方で、LC-MS/MSを用いて甲状腺ホルモン濃度（総T4,T3）を詳細分析した結果、計画時の予想に反して、PCBs曝露による甲状腺ホルモン濃度への影響は見られなかった。このメカニズムに関しては今後の詳細な解析が必要となるが、ネコ血清中に残留する代謝物のOH-PCBsを分析した結果、代謝生成したOH-PCBsは3,4塩素を持つ低塩素体であったため、これらのOH-PCBsが血中で甲状腺ホルモン輸送タンパクに対して結合能を示さなかったことが推察された。今年度はさらにTSHおよび遊離型甲状腺ホルモン（Free T4, T3）の分析に取り組むことで、より詳細な甲状腺ホルモンへの影響のメカニズムを解析することができると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

1) 甲状腺ホルモンの分析と影響評価：　甲状腺刺激ホルモン(TSH)レベルを測定し、PCBsおよびOH-PCBs曝露による影響を検証する。さらに、分析の難しい遊離型甲状腺ホルモン（Free T4, T3）に及ぼす影響も明らかにし、甲状腺機能亢進症など甲状腺機能障害との関連性を統計学的手法により解析する。本研究グループはすでに液体クロマトグラフタンデム質量分析計(LC-MS/MS)を用いた野生生物の血清中の総・遊離甲状腺ホルモン分析法を確立しており、ペット血清中の甲状腺ホルモン分析には本方法を適用する。
2) 脳を対象としたプロテオーム解析：　大脳新皮質から、ミトコンドリア画分、サイトゾル画分、ミクロソーム画分を抽出する。これらの画分からタンパク質を抽出し、等電点電気泳動とSDS-PAGEを組み合わせた2DEによりタンパク質を分離する。PCBsおよびOH-PCBs曝露レベルに依存して発現レベルが変化するタンパク質をMALDI-TOF/TOF-MSにより同定し、マッピング解析を実施する。これにより、PCBs、OH-PCBs曝露によって脳内で亢進または抑制されたタンパク質を明らかにする。加えて、発現レベルが変化したタンパク質は、Western blottingにより定量する。
3) ネコのin vivo PBDEs長期曝露試験：　ネコ（Narc:Catus）のin vivo PBDEs慢性曝露試験を実施する。餌やハウスダスト中で高濃度蓄積が報告されているBDE209 (1 mg/kg)を毎週1回、48週間経口投与し、投与開始前および投与後4週間ごとに頸静脈から約2 mLを採血し血清を分離する。投与後 4週間ごとに尿、糞便も採取する。投与後48週間目に安楽死させ、臓器・組織を摘出し分析に供する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Kasetsart University/Veterinary Medicine(Thailand)
  • Country Name: Thailand
  • Counterpart Institution: Kasetsart University/Veterinary Medicine
• [Journal Article] Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their hydroxylated and methoxylated analogues in the blood of harbor, Dall's and finless porpoises from the Japanese coastal waters. (2017)
  • Author(s): Ochiai, M., Nomiyama, K., Isobe, T., Yamada, T. K., Tajima, Y., Matsuda, A., Shiozaki, A., Matsuishi, T., Amano, M., Iwata, H. and Tanabe, S.
  • Journal Title: Marine Environmental Research Volume: 128 Pages: 124-132
  • DOI: 10.1016/j.marenvres.2016.11.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of Species Differences in Xenobiotic Metabolism in Non-experimental Animals. (2017)
  • Author(s): Mizukawa H, Ikenaka Y, Kakehi M, Nakayama S, Ishizuka M
  • Journal Title: Yakugaku Zasshi Volume: 137(3) Pages: 257-263
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Accumulation features of organohalogen compounds and their hydroxylated metabolites in pet cats and dogs: effects on thyroid hormones homeostasis. (2016)
  • Author(s): Nomiyama, K., Yamamoto, Y., Mizukawa, H., Eguchi, A., Nakayama, S. M., Ikenaka, Y., Ishizuka, M., Kunisue, T. and Tanabe, S.
  • Organizer: SETAC North America 37th Annual Meeting/7th SETAC World Congress
  • Place of Presentation: Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Characteristic for biotransformation of polychrolinated biphenyls in cats. (2016)
  • Author(s): Mizukawa, H., Maehara, M., Yokoyama, N., Ichii, O., Takiguchi, M., Nomiyama, K., Nishikawa, H., Ikenaka, Y., Nakayama, S. M., Takaguchi, K., Tanabe, S., Ishizuka, M.
  • Organizer: SETAC North America 37th Annual Meeting/7th SETAC World Congress
  • Place of Presentation: Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cross omics analysis for PCBs toxicity in the dog brain - Effect on mitochondrial functions- (2016)
  • Author(s): Takaguchi, K., Nomiyama, K., Yoo, J., Mizukawa, H., Iwata, H., Kunisue, T. and Tanabe, S.
  • Organizer: SETAC North America 37th Annual Meeting/7th SETAC World Congress
  • Place of Presentation: Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In vitro and in silico assessment of cytochrome P450-dependent biotransformation capacity of PCBs in the Caniformia; the Baikal seal vs the beagle dog (2016)
  • Author(s): Iwata, H., Yoo, J., Tamura, S., Hirano, M., Nomiyama, K. and Tanabe, S.
  • Organizer: SETAC North America 37th Annual Meeting/7th SETAC World Congress
  • Place of Presentation: Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
• [Presentation] Toxicological assessment of PCBs and OH-PCBs in the brain of dogs using metabolic approach. (2016)
  • Author(s): Nomiyama, K., Takaguchi, K., Eguchi, A., Mizukawa, H., Yoo, J., Tamaru, S., Oshihoi, T., Iwata, H., Kunisue, T. and Tanabe, S.
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場, 兵庫, 神戸市
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] In vivo analysis of PCB metabolic capacities and effects on the thyroid hormone in cats. (2016)
  • Author(s): Mizukawa, H., Maehara, M., Yokoyama, N., Ichii, O., Takiguchi, M., Nomiyama, K., Nishikawa, H., Takakuchi, K., Saengtienchai, A., Sainnoxoi, T., Ikenaka, Y., Nakayama, S. M. M., Tanabe, S. and Ishizuka, M.
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場, 兵庫, 神戸市
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Disruption of mitochondrial functions by PCB exposure in the dog brain: Toxicological assessment using cross omics. (2016)
  • Author(s): Takaguchi, K., Nomiyama, K., Eguchi, A., Claret, L. M., Kusaki, M., Yoo, J., Mizukawa, H., Iwata, H., Kunisue, T. and Tanabe, S.
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場, 兵庫, 神戸市
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Hepatic transcriptome analysis to assess the effects of polychlorinated biphenyls on beagle dogs (2016)
  • Author(s): Tamura, S., Agusa, T., Hirano, M., Eguchi, A., Nomiyama, K., Tanabe, S., Kim, E. and Iwata, H.
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場, 兵庫, 神戸市
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Quantitative structure-relationships (QSAR) models for prediction of gas chromatography retention of methoxylated polychlorinated biphenyl using regularized multiple linear regressions (2016)
  • Author(s): Eguchi, A., Nomiyama, K., Takaguchi, K. and Mori, C.
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場, 兵庫, 神戸市
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Contamination status of organohalogen compounds and their hydroxylated metabolites in pet cats and dogs: effects on thyroid hormones homeostasis. (2016)
  • Author(s): Nomiyama, K., Yamamoto, Y., Mizukawa, H., Takaguchi, K., Takiguchi, M., Eguchi, A., Nakayama, S., Ikenaka, Y., Ishizuka, M., Kunisue, T. and Tanabe, S.
  • Organizer: 36th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants (DIOXIN 2016)
  • Place of Presentation: Firenze, Italy
  • Year and Date: 2016-08-28 – 2016-09-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] クロスオミックスによるイヌ脳のPCBs毒性評価 (2016)
  • Author(s): 高口倖暉・野見山 桂・Claret, L. M.・Jean, Y.・水川葉月・岩田久人・国末達也・田辺信介
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • Place of Presentation: 北里大学薬学部白金キャンパス, 東京, 港区
  • Year and Date: 2016-07-28 – 2016-07-29
• [Presentation] メタボローム解析を用いたイエネコにおけるPCBsの毒性影響評価 (2016)
  • Author(s): 西川博之・野見山桂・水川葉月・横山 望・市居 修・滝口満喜・石塚真美・池中良徳・中山翔太・江口哲史・国末達也・田辺信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター, 新潟, 新潟市
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] ネコにおけるポリ塩化ビフェニル（PCBs）の異物代謝機構解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 水川葉月・前原美咲・横山 望・市居 修・滝口満喜・野見山 桂・西川博之・池中良徳・中山翔太・高口倖暉・田辺信介・石塚 真由美
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター, 新潟, 新潟市
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] 有機ハロゲン化合物によるコンパニオンアニマルの汚染実態と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 野見山 桂・山本恭央・水川葉月・江口哲史・滝口満喜・中山翔太・池中良徳・石塚 真由美・国末 達也・田辺信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター, 新潟, 新潟市
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] クロスオミックスによるイヌ脳へのPCBs 毒\性評価：ミトコンドリア機能へ及ぼす影響解析 (2016)
  • Author(s): 高口倖暉・野見山 桂・Claret, L. M.・草木桃子・Jean, Y.・水川葉月・岩田久人・国末達也・田辺信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター, 新潟, 新潟市
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] メタボロミクスアプローチを用いたイヌ脳へのOH-PCBs 毒性機序の解明 (2016)
  • Author(s): 野見山 桂・高口倖暉・江口哲史・水川葉月・Jean, Y.・田村沙弥・忍穂井 智子・岩田久人・国末達也・田辺信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター, 新潟, 新潟市
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Remarks] 愛媛大学沿岸環境科学研究センター化学汚染・毒性解析部門
  • URL: http://kanka.cmes.ehime-u.ac.jp/