2017 Fiscal Year Annual Research Report
微小孔アレイと微小電極アレイを用いた細胞共培養と細胞外電位計測
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16H03171
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
安田 隆 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 教授 (80270883)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | マイクロデバイス / 半導体加工 / 細胞培養 / 細胞解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
直径約3μmの微小孔をアレイ状に有する厚さ約1μmの窒化シリコン製の多孔膜を製作した。この裏面にコラーゲン、表面にラミニンを修飾した後に、裏面にアストロサイト、表面に神経細胞を順次培養し、多孔膜を挟んだ共培養を行った。微小孔アレイを通じた細胞間コミュニケーションの効果を定量的に評価するために、微小孔ピッチを数μmから数10μmの範囲で変更して共培養を行い、神経細胞のシナプスに局在する膜タンパク質（小胞型グルタミン酸トランスポータ1）を免疫染色法により蛍光染色した後に、各微小孔ピッチにおけるシナプス数をカウントし比較を行った。その結果、微小孔ピッチを50μmまで大きくするとシナプス数が少なくなり（すなわち神経細胞の活性が低くなり）、微小孔ピッチを20μm以下にすることで神経細胞の活性を高めることができることが分かった。また、窒化シリコン多孔膜上に1辺約300μmの矩形ウェルのアレイ構造を形成し、各ウェル底面（多孔膜表面）に単一の神経細胞を、多孔膜裏面に多数のアストロサイトを培養することで、単一神経細胞を長期培養する技術を構築した。
さらに、窒化シリコン膜の片面に1辺約50μmの微小電極を8×8個のマトリックス状に形成し、細胞外電位を計測するためのデバイスを製作した。まず、微小電極アレイ上にラット海馬スライスを設置し、薬剤刺激を行いながらスライスの電位を計測することで、本デバイスの性能を評価するとともに計測環境を構築した。次に、微小電極アレイ形成面にラミニンを修飾し、神経細胞とアストロサイトを順次播種して共培養を行った。神経細胞の細胞外電位を計測した後に、神経細胞のβ-Tubulin IIIを蛍光染色することで、微小電極上への神経細胞の接着状態を評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書の研究実施計画に記載した二つの課題、すなわち窒化シリコン多孔膜を挟んで神経細胞とアストロサイトを共培養し多孔膜の微小孔ピッチが細胞活性に与える影響を定量的に評価すること、及び微小電極アレイを形成した窒化シリコン膜上で細胞外電位を計測する技術を構築することに成功し、当初目標としていた成果を得ることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
シリコン基板を加工することでマイクロウェルアレイを製作し、その底面に多数の微小孔を有する窒化シリコン製の多孔膜を形成する。この多孔膜両面に細胞接着分子を修飾した後に、多孔膜裏面に多数のアストロサイトを、個々のマイクロウェル内の多孔膜表面に単一の神経細胞を順次培養し、窒化シリコン多孔膜を挟んだ共培養を行う。培養された単一神経細胞は、微小孔を通じてアストロサイトから物質供給を受けながら成長し、軸索を伸展させて自身の樹状突起と自己回帰性シナプスを形成する。このとき、神経細胞とアストロサイトの間で良好な細胞間コミュニケーションが形成されていれば、培養日数の経過とともにシナプス数が増加し、神経細胞の活性が長期に渡って維持されることを期待できる。この効果を定量的に評価するために、神経細胞のシナプスに局在する膜タンパク質を蛍光染色することでシナプス数をカウントし、シナプス数の経時変化を調べる。
さらに、シリコン基板で支持された窒化シリコン製の自立膜の表面に、64個の微小電極を8×8のマトリックス状に形成するとともに、多数の微小孔を形成する。この窒化シリコン多孔膜の電極形成面に神経細胞とアストロサイトを共培養し、前年度に構築した表面処理技術や電位計測技術の改良を行い、神経細胞の細胞外電位の計測に必要な基盤技術を確立する。次に、窒化シリコン多孔膜の電極非形成面にアストロサイトを、電極形成面に神経細胞を順次培養し、窒化シリコン多孔膜を挟んで共培養を行った状態で、神経細胞の細胞外電位を計測する技術を構築する。
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