2018 Fiscal Year Annual Research Report
微小孔アレイと微小電極アレイを用いた細胞共培養と細胞外電位計測
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16H03171
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
安田 隆 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 教授 (80270883)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | マイクロデバイス / 半導体加工 / 微小電極 / 共培養 / 電位計測 / 神経細胞 / アストロサイト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シリコン基板を加工することで角型のマイクロウェルをアレイ状に製作し、各ウェルの底面（一辺300μm）に多数の微小孔（直径3μm）を有する窒化シリコン（SiN）製の自立膜（厚さ1μm）を形成した。この膜の裏面にコラーゲンを、膜表面にラミニンを修飾し、膜裏面に大量のアストロサイトを、膜表面に単一の神経細胞を順次播種し、SiN多孔膜を挟んだ共培養を行った。単一神経細胞は、微小孔を通じてアストロサイトと相互作用しながら成長し、軸索を伸展させて自身の樹状突起とシナプスを形成する。このとき、神経細胞とアストロサイトの間で良好な細胞間コミュニケーションが形成されていれば、培養日数の経過とともにシナプス数が増加し、神経細胞の活性が長期に渡って維持される。この効果を定量的に評価するために、シナプスに局在する小胞型グルタミン酸トランスポータを蛍光染色することでシナプス数をカウントし、シナプス数の経時変化を調べた。その結果、共培養開始から2週間でシナプス数が急激に増加し、それ以降はシナプス数が高いレベルで維持され、5週間に渡って神経細胞の高活性が維持された。
次に、SiN自立膜（厚さ約2μm）の中心部1.1mm角の領域に、白金黒製の微小電極（1辺54μm）を8×8個のマトリックス状に形成した。このSiN膜の電極形成面にラミニンを修飾した後に、神経細胞とアストロサイトを播種し、同一面上で共培養を行った。共培養10日目に、神経細胞の典型的な細胞外電位波形である二相性のスパイク信号列を計測することに成功した。さらに、SiN膜に多数の微小孔（直径約6μm）を形成した。SiN膜の電極非形成面にコラーゲンを、電極形成面にラミニンを修飾した後に、電極非形成面にアストロサイトを、電極形成面に神経細胞を順次培養し、SiN膜を挟んで共培養を行った。共培養9日目に、神経細胞の細胞外電位を計測することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究の目標は、半導体加工技術を用いて微小孔アレイと微小電極アレイを有するSiN製の膜状構造体を製作し、SiN膜の両面に異種細胞を培養することで微小孔アレイを通じた良好な細胞間コミュニケーションを実現し得る共培養技術を構築するとともに、表面側に培養した細胞の電気的信号を微小電極アレイにより多点で計測する技術を構築することである。
本研究では、現在までにすでに最終目標に近い段階の成果が得られている。さらに、本共培養法の有効性を単一細胞レベルで定量評価する手法の構築は、当初の研究計画に無かったものであり、当初目標を上回る成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
SiN多孔膜を介して単一神経細胞とアストロサイト群の共培養系を構築する技術を改良する。マイクロウェル底面のSiN多孔膜を用いたこれまでの方法では、大きな凹凸構造を有するウェルアレイへの表面処理に不具合が生じたため、単一神経細胞培養の成功率が極めて低い結果となった。今後は、これを解決するために、シリコン製の円形フレームで支持された比較的広いフラット面を有するSiN多孔膜を製作し、この膜表面に単一神経細胞を配列する技術を構築する。そして、膜裏面のアストロサイト群との共培養系において、単一神経細胞のシナプス数をカウントし、神経細胞の活性を定量的に評価することで、本共培養技術の有効性を実証する。
次に、SiN自立膜の表面に64個の微小電極と多数の微小孔を形成したデバイスを製作し、SiN膜裏面の電極非形成面にアストロサイトを、電極形成面に神経細胞を順次培養する技術を最適化する。このデバイスの外周部にはアンプ装置との電気的接続に必要な電極パッド・アレイが形成されているため、これを培養液等で汚染せずにSiN膜両面への表面修飾及び細胞播種を確実に行う必要がある。そのため、SiN膜両面に形成する培養チャンバ等の構造や製作方法を最適化するとともに、表面修飾と細胞播種の手順や条件を最適化する。その後に、SiN膜を挟んで共培養を行った状態で、神経細胞の細胞外電位を多点で計測する技術を確立する。
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