2016 Fiscal Year Annual Research Report
Tissue ingrowth into poly(lactic acid) porous scaffolds by use of PLA/peptide bifunctional molecules
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16H03186
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
山岡 哲二 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (50243126)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
徐 ユイ 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 流動研究員 (10757678)
神戸 裕介 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 流動研究員 (30747671)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 再生医工学材料 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポリ乳酸からなる生体吸収性多孔質スキャホールドを用いた真皮組織等の軟組織再生を進めている。“幹細胞等を用いない三次元組織のin vivo 再生”が広く検討されているが、臨床の場では、骨組織再生用の多孔質セラミックス（いわゆる人工骨・骨補填材）の利用がすすんでいるのみである。多孔質コラーゲンからなる真皮欠損用グラフトにおいても、肉芽様組織にとどまる。そこで、新たな機能性多孔質スキャホールドを作成する目的で、組織再生のための組織親和性ペプチドに加えて、それをスキャホールドへ固定化するためのスキャホールド親和性を一分子中に保持したバイファンクショナル分子を開発し、ポリ乳酸系スキャホールドを修飾し評価した。
バイファンクショナル分子はFmoc固相合成法により合成した。生理活性ペプチド配列、そのタンデム・繰り返し配列、さらにコントロールの入替え配列を合成した。得られたバイファンクショナル分子とポリ乳酸との複合化を行った場合、生理活性ペプチド配列が表面に効率よく、また、安定に露出しているかが重要である。特異的に作用する細胞を播種して培養したところ、この効率が十分でないことが示されていた。従来のESCA測定やIR測定などでは、ある程度の深さに存在する分子の存在と分布を解析してしまうが、細胞、最表面に露出した分子のみを認識するのでこれらの評価は一致しない。そこで、修飾後に反応可能アミノ酸配列に対して水相から蛍光標識することで、最表層に露出している機能性ペプチドのみを定量的に解析する事を可能とした。その情報に基づいて、表面露出効率の高い分子を設計するとともに最表面のペプチド分子露出効率を向上させる処理方法を見いだしたので本年度に特許を申請した。また、得られた修飾ポリ乳酸スキャホールドに対する細胞親和性の向上も確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、最表面へ露出しているペプチド量が不明であったために、細胞や組織とスキャホールドとの相互作用のメカニズムを考察することが困難であった。修飾後に反応可能アミノ酸配列に対して水相から蛍光標識することで、最表層に露出している機能性ペプチドのみを定量的に解析する事を可能としたことは、大きな進展をもたらした。その情報に基づいて、表面露出効率の高い分子を設計するとともに最表面のペプチド分子露出効率を向上させる処理方法を見いだした特許申請できたこともありおおむね順調と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
スキャホールド表面の効率的な修飾のための新たなバイファンクショナル分子の設計と合成およびその評価に時間を要し、ラット全層皮膚欠損モデルへの埋入実験は予備的検討のみとなった（計画通り）。
今後は、雄性ウィスターラット背部に１．５cm×１．５cmの全層欠損を作製し、二重構造人工真皮を移植、１，４、８週後に、切片などの解析を進める。ラットの皮膚再生能力は、人に比較して極めて高く、非臨床POC（Proof of Concept）取得のためのモデルとして必ずしも適しているわけではないが、スクリーニング手法として採用している。処置後、欠損の面積を測定、b)一般的HE染色（拘縮・治癒の評価、治癒を大きく遅らせる事が知られているカプセル化反応をその厚みとヘマトキシリン染色濃度から評価）、CD68（マクロファージ染色：炎症・治癒の過程）、CD31・フォンビレブランド因子免疫染色（血管網構築）、エラスチカワンギーソン染色（スキャホールド中に再生したECM成分のコラーゲン及びエラスチンの染色）を実施する。c)ピンオンディスク押し込み試験により再生真皮の力学的強度を評価する。今年度は、ラット実験を遂行し、最終年度にはミニブタ皮下移植真皮再生実験モデルを実施する計画である。
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