2017 Fiscal Year Annual Research Report
Cell-penetrating proteins generated by modification with naturally occurring polycationic polymer
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16H03284
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
濱野 吉十 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50372834)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸山 千登勢 福井県立大学, 生物資源学部, 講師 (20452120)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 生体膜透過性 / ポリカチオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、タンパク質・酵素のような高分子物質を直接細胞内に送達させる革新的新技術として、タンパク質・酵素の天然ポリカチオン修飾による生体膜透過性改善を目指している。本技術を確立できれば、抗体医薬などのバイオ医薬品の新しい送達法を提供でき、また、タンパク質・酵素の機能について詳細な時間軸で解析することが可能になる。具体的には、官能基化ポリαあるいはポリβリジンエステルを用いたクリックケミストリーによるタンパク質・酵素のポリカチオン修飾技術の基盤を確立する（研究項目A）。さらに、ポリカチオン修飾されたタンパク質・酵素の細胞膜透過性を評価するとともに、その機能発現を評価する（研究項目B）。また、ポリαリジンやポリβリジン以外の天然ポリカチオン化合物を微生物から探索し、ポリカチオン修飾ツールの拡充を図る（研究項目C）。
平成29年度は、ε-PL-PEG4-アジドを用いポリカチオン修飾した蛍光タンパク質（Azami green）が実際に生体膜を透過できるか検証した。ヒトガン細胞（HeLa細胞）を用いて生体膜透過性を検証したところ、高分子のタンパク質であってもポリカチオン修飾によって生体膜透過性を付与できることを確認した（研究項目AおよびB）。さらに、微生物ゲノムマイニングによって新規ポリカチオン化合物の探索を行ったところ、放線菌において新規ポリカチオンポリマーとしてε-ポリ-β-リジン、およびD体ポリカチオンポリマーとしてγ-ポリ-D-ジアミノブタン酸を同定した（研究項目C）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【研究項目A：官能基化ポリαおよびポリβリジンエステルによるタンパク質・酵素の修飾】ε-PL-PEG4-アジドによるポリカチオン修飾法は、タンパク質表面に存在するリジン残基のアミノ基を利用した修飾法であり、複数カ所のポリカチオン修飾が導入される。そこで、1カ所のポリカチオン修飾法としてHaloタグを利用した手法について検討したが、良い結果が得られなかった。そこで、ε-PL-PEG4-アジドを用いても1カ所だけポリカチオン修飾できる修飾条件を確立した。この条件にて、蛍光タンパク質（Azami green）をε-PL-PEG4-アジドでポリカチオン修飾したところ、生体膜透過性を観察できた。
【研究項目B：ポリカチオン修飾タンパク質・酵素の細胞膜透過性および機能発現評価】ポリカチオン修飾したタンパク質・酵素の細胞膜透過性および機能発現評価には動物細胞の培養実験系が必要であり、HeLa細胞を用いてきた。現在、その他の動物細胞においても同様の効果が得られるかHAK293細胞などの付着培養細胞、あるいは、浮遊培養細胞を用いて検証を進めている。
【研究項目C：微生物由来新規ポリカチオン化合物の探索】タンパク質・酵素のポリカチオン修飾には、当研究室で既に利用できる「ポリαリジン」や「ポリβリジン」を先ずは使用するが、それ以外の天然ポリカチオン化合物を微生物から探索し、ポリカチオン修飾ツールの拡充を図る計画である。微生物ゲノムマイニングによって新規ポリカチオン化合物の探索を行ったところ、放線菌において新規ポリカチオンポリマーとしてε-ポリ-β-リジン、およびD体ポリカチオンポリマーとしてγ-ポリ-D-ジアミノブタン酸を同定した（研究項目C）。
以上、研究項目全体としては、当初の計画通りに進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
【研究項目A：官能基化ポリαおよびポリβリジンエステルによるタンパク質・酵素の修飾】蛍光タンパク質（Azami green）をε-PL-PEG4-アジドでポリカチオン修飾したところ、生体膜透過性を観察できたことから、タンパク質のような高分子においてもポリカチオン修飾が生体膜透過性に有効であることがわかった。そこで、より実用的な応用例として、トリプシンなどのプロテアーゼ、Creリコンビナーゼなどにおいてもポリカチオン修飾条件を検討する。
【研究項目B：ポリカチオン修飾タンパク質・酵素の細胞膜透過性および機能発現評価】現在、HeLa細胞を用いて、ポリカチオン修飾した蛍光タンパク質（Azami green）の細胞膜透過性について検証中であるが、より実践的な応用利用に向けた検討を始める。動物細胞に直接導入したい候補タンパク質・酵素は多数考えられるが、MALDI質量分析による動物組織のイメージング解析への応用利用を目指し、動物組織切片とプロテアーゼを実験モデルとして検証を開始する。
【研究項目C：微生物由来新規ポリカチオン化合物の探索】引き続き、微生物ゲノムマイニングによって微生物から新規ポリカチオン化合物の探索を行い、ε-PL以外のポリカチオン化合物生産菌を同定する。さらに、連携研究者である山中一也 准教授（関西大学）と共同開発中であるin vivoクローニングと異種発現を基盤とした新手法による新規天然ポリカチオン化合物の取得を実践する。
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[Journal Article] Partition of amines and lysine oligomers between organic solvent and water under a controlled interfacial potential difference2018
Author(s)
Katano, H., Maruyama, M., Kuroda, Y., Uematsu, K., Maruyama, C., Hamano, Y.
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Journal Title
J. Electroanal. Chem.
Volume: 820
Pages: 97-102
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Imaging mass spectrometry analysis of ubiquinol localization in the mouse brain following shortterm administration2017
Author(s)
Tatsuta, T., Kasai, K., Maruyama, C., Hamano, Y., Matsuo, K., Katano, H., Taira, S.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 12990
DOI
Peer Reviewed
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