マイクロRNA機能のダイナミズム可視化システムの開発

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H03295
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 中島 芳浩 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 健康工学研究部門, 研究グループ長 (10291080)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安永 茉由 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 健康工学研究部門, 研究員 (70712181) ; 赤澤 陽子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究員 (50549897) ; 萩原 義久 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究部門付 (50357761)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: miRNA / ルシフェラーゼ / セルベースアッセイ / イメージング / 生体分子計測

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、miRNAによる遺伝子発現抑制を、独自に開発したブラジル産ヒカリコメツキムシ（Pyrearinus termitilluminans）由来緑色発光ルシフェラーゼ（ELuc）および鉄道虫（Phrixothrix hirtus）由来赤色発光ルシフェラーゼ（SLR3）に対するナノボディー抗体を用い、鋭敏に検出する新規モニターシステム構築を行う。本年度は、ELucおよびSLR3を大腸菌で発現・精製した標品を作製、これらをラクダ科動物に複数回免疫し、両ルシフェラーゼに対する抗体価の上昇を確認後、部分採血した。続いて、白血球成分由来mRNAから特異的プライマーを用いナノボディー抗体cDNAを増幅し、ファージベクターにクローニングした抗ルシフェラーゼ抗体ライブラリーを作製した。
次に、抗ルシフェラーゼ抗体のスクリーニングのため、両ルシフェラーゼタンパク質のプレート上への固定化方法を検討した。ルシフェラーゼタンパク質の疎水性を利用し、直接プレートに固定化する方法と、ルシフェラーゼタンパク質に融合したFlagタグを利用し、抗Flagタグ抗体を予めプレート上に固定化してからFlagタグを介して固定化する方法について検討したところ、後者がより優れていることが明らかとなった。そこで、精製ELucおよびSLR3タンパク質を抗Flag抗体を介して96ウェルマルチプレートに固定し、バイオパンニングによりELuc或いはSLR3に結合するファージクローンをスクリーニングした結果、ELucに対し特異的に結合する複数のファージクローンを取得することに成功した。一方、SLR3に対して特異的に結合するファージクローンは得られなかった。さらに、ELucに結合するファージクローンからナノボディー抗体cDNAの配列を解析し、複数の候補抗体を得ることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該研究の根幹をなす、ルシフェラーゼに対するナノボディー抗体候補が複数取得でき、当初予定通り概ね順調に研究は進展している。

Strategy for Future Research Activity

取得したルシフェラーゼ阻害抗体を大腸菌で発現、精製し、試験管内でルシフェラーゼに対する阻害活性を測定する。さらに、ルシフェラーゼ阻害抗体の多価化などのタンパク質工学を施し、発光活性阻害の最適化を図る。さらに、哺乳類細胞内で候補抗体が想定通りにルシフェラーゼの発光を阻害するかを検証する。これらと並行し、SLR3抗体候補の取得を試みる。