2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of visualizing system of microRNA dynamism
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16H03295
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
中島 芳浩 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (10291080)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤澤 陽子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (50549897)
加藤 太一郎 鹿児島大学, 理工学域理学系, 助教 (60423901)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 生体分子計測 / miRNA / ルシフェラーゼ / 低分子抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、これまでに取得した緑色発光ルシフェラーゼELucに対するナノボディー阻害抗体（抗ELuc抗体）について、今後のmiRNA機能評価において基盤的となる生化学的情報を収集した。まず、親和性を解析するため、6種類の抗ELuc抗体を大腸菌で発現・精製し、精製ELucタンパク質に対する解離定数（Kd）を求めた。その結果、いずれの抗ELuc抗体においてもKd値はnMオーダーであることが明らかとなった。これらの抗体がELucタンパク質に対して反応阻害を示すことと、今回得られた結果を併せて考慮すると、当該研究の一つの目的である細胞内ナノボディー阻害抗体の導出という観点で、取得した抗体は有望な候補であることが示唆された。
続いて、抗体の阻害様式を明らかにするため、酵素反応速度論的解析を行った、解析にはELucのC末端を認識する1種類の抗体を代表例として用いた。一定濃度の抗体に濃度を変えた発光基質を添加し、生じる発光を測定してLineweaver-Burkプロットを作成した。その結果、非拮抗阻害型の阻害様式を示し、またその阻害定数は約0.5 μMであることが明らかとなった。解析した抗体がELucの活性部位とは比較的遠い距離にあるC末端を認識することを考慮すると、阻害様式が非拮抗型であることは理にかなった結果であった。
次に、使用可能な抗ルシフェラーゼ抗体の選択肢を拡充するため、赤色ルシフェラーゼSLR3に対する抗体の単離を試みた。ELucをアルパカに免疫する際、SLR3も同時に免疫をしており、研究初年度に作製したファージライブラリーを用いSLR3を抗原にバイオパンニングを実施した結果、8種類の独立した配列のクローンを取得した。さらに大腸菌で発現・精製し、SLR3に対して親和性と発光阻害を示すことを確認し、当該研究における新たなツールを導出することに成功した。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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