2016 Fiscal Year Annual Research Report
ペプチド鎖を活用する超高親和性RNA結合リガンドの創成と応用
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16H04159
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
西澤 精一 東北大学, 理学研究科, 教授 (40281969)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 雄介 東北大学, 理学研究科, 助教 (90583039)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ノンコーディングRNA / リガンド / 検出 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトゲノム・遺伝子解析研究の進展と相まって、20～30塩基長のノンコーディングRNA（ncRNA; タンパク質に翻訳されずに機能するRNA）が関与する新規な遺伝子発現調節機構の発見が相次ぎ、ncRNAは、ポストゲノム時代の生命科学研究における重要な研究対象となっている。
本研究では、ncRNAの高感度検出(in vitro)と生細胞内可視化のためのケミカルプローブとして、RNA結合タンパク質に匹敵する結合力と選択性を兼ね備えたRNA結合リガンドを開発することを試みる。具体的には、miRNAやsiRNA等を研究対象とするもので、蛍光性RNA結合リガンドを利用するncRNA解析法を提案、新規な分析方法論としての有用性を実証するとともに、その技術基盤を確立することを目指す。
平成28年度は、三重鎖形成プローブの設計・合成と機能評価を重点的に進めた。その結果、RNA二重鎖（塩基配列）を検出する蛍光性ペプチド核酸（PNA）プローブを世界に先駆けて開発することに成功した。具体的には、蛍光色素（チアゾールオレンジ）を疑似塩基として組み込んだもので、我々はこのプローブを新しくtFIT（triplex-forming forced intercalation of thiozole orange）プローブと名付けた。DNA を骨格とする従来の三重鎖形成核酸プローブと比較して、tFITプローブの優れた特性は、（i）RNA二重鎖結合タンパク質（受容体）に匹敵する結合力を発現すること、（ii）世界最高レベルのoff-on型の蛍光応答を示すこと（単一の蛍光色素を含むRNA 結合性核酸プローブとして）、また、（iii）極めて迅速（～180秒）かつ塩基配列選択的に三重鎖形成が進行することで、従来、困難とされてきたRNA二重鎖構造（塩基配列）の迅速な検出が可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」で述べたように、現段階において、蛍光色素（チアゾールオレンジ）を疑似塩基として組み込んだペプチド核酸（PNA）プローブを用いることで、RNA二重鎖構造（塩基配列）の迅速な検出が可能であることを見出している。さらに「オーバーハング結合部位」と「三重鎖形成部位」とを連結したリガンドの合成を完了し、現在、その基本性能（結合定数や結合選択性、蛍光特性など）について詳細な評価を進めている（「今後の研究の推進方策」を参照）。また、「正電荷性のアミノ酸からなるペプチド鎖」を連結したリガンドに関しても、その合成と基本性能の評価を進めており、基本性能に関する予備検討では良好な結果を得ている。今後、生細胞内や実試料を対象としたイメージング・検出機能等について評価するとともに、これらのRNA結合リガンドの機能改良をさらに進めることで、実用に供しうる分析法としての有用性を実証できることが期待できる。
以上のように、本研究は、おおむね順調に進展していると自己評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
概ね当初の研究計画に従って研究を進める。すなわち、申請者らが独自に開発を進めてきた、「オーバーハング結合リガンド」及び「AP site結合リガンド」をベースとして、これらに、「正電荷性のアミノ酸からなるペプチド鎖」及び「ペプチド核酸（三重鎖形成部位）」を連結することで、高親和性・高選択性のRNA結合リガンドを設計・合成する。新たに合成したRNA結合リガンドについて、RNAとの相互作用(in vitro)を評価し、RNA結合リガンドの基本性能（結合定数や結合選択性、蛍光特性など）について評価する。得られた知見をベースとして、RNA結合リガンドの改良合成にフィードバックし、各RNA結合リガンド機能の最適化を図る。さらに、生細胞内でのsiRNAイメージング機能、実試料を対象としたmiRNA検出機能等について評価する。
以上のように研究を遂行し、RNA結合リガンドに基づくRNA解析法（in vitro検出と細胞内イメージング）の有用性を実証、新規な分析方法論としての技術基盤を確立することを目指す。
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