2017 Fiscal Year Annual Research Report
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16H04162
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RNA / 1分子計測(SMD) / ナノバイオ / イメージング / 細胞 / 蛍光プローブ / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では新規な定量的RNAプローブの開発および１分子可視化RNAプローブの開発を基軸として生細胞内におけるRNA動態の包括的な可視化解析技術の創出を目的に進めている。前者については前年度に作成したddGFPを用いたプローブに加え、退色の影響を受けずより長時間検出が可能な、二分割ルシフェラーゼを用いた発光プローブを作成した。NanoLucの二分割断片をそれぞれβアクチンmRNAの3' UTRを標的とするmPUM3およびmPUM4に融合し、βアクチンmRNAプローブとした本プローブが標的RNAに結合すると二分割NanoLuc断片が近接し、NanoLucが再構成することで発光能を回復する。一方標的RNAが消失するとプローブが互いに離れ、NanoLucが再び二分割断片となることで蛍光性が消失する。本プローブの遺伝子を作成し、大腸菌発現系からプローブを単離精製した。得られたプローブと標的配列を有する合成RNAを混合し、その後RNaseを加える実験を行った。その結果、標的RNA存在下で発光を示し、そのRNAが分解することで発光能を消失するプローブの開発に成功した
また後者については、前年度までに達成した機能性RNA TERRAの１分子イメージングについて、より長時間の１分子動態追跡の実現を目指し、二分割GFPに代わって二分割SNAPタグを用いたTERRAプローブを開発した。本プローブを培養細胞内に導入し、SNAPタグをテトラメチルローダミンで標識した後化学固定し、TERRAをオリゴ核酸プローブを用いて標識したところ、本プローブとオリゴ核酸プローブの局在はよく一致した。すなわち、本プローブを用いて細胞内のTERRAを蛍光標識することを実現した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
定量的RNAプローブの開発においては、当初予定していた蛍光プローブに加え、より長時間の定量検出が可能な発光プローブのプロトタイプの開発にまで成功した。またTERRAプローブについても、当初の計画通りSNAPタグを利用したプローブを開発し、細胞内のTERRA標識に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
定量RNA可視化プローブについては、発光イメージングを通じた生細胞内RNA可視化定量を目指す。具体的には繊維芽細胞に開発したプローブを導入し、血清刺激の添加・除去を通じて生じるβアクチンmRNAの増加・減少、および細胞内局在変化の観察を行う。この実験を通じ、可逆的仁応答するRNAプローブを用いた生細胞内長時間RNA定量検出の概念実証を行う。またTERRAプローブにおいては開発したSNAPタグベースのTERRAプローブを用いてTERRAの長時間１分子動態追跡を目指す。そのさい、サンプルの細胞に同調をかけ、Fucciなどの細胞周期プローブを発現させておくことで、細胞周期依存的なTERRAの動態を見出すことを目指す。この解析を通じ、TERRAがテロメア長制御にどのような機構を通じて関与しているのか解明を目指す。
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