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2018 Fiscal Year Annual Research Report

Development of comprehensive visualization techniques to monitor RNA dynamics in living cells

Research Project

Project/Area Number 16H04162
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

吉村 英哲  東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2019-03-31
KeywordsRNA / 1分子計測(SMD) / ナノバイオ / イメージング / 細胞 / 蛍光プローブ / バイオイメージング
Outline of Annual Research Achievements

H30年度はRNA定量発光プローブの開発を中心に行った。具体的には独自に開発したmPUMテクノロジーと二分割NanoLucを用い、標的RNAに結合すると発光能を回復するRNA発光プローブの開発を重点的に行った。前年度にmPUMと二分割RNAからなるプローブが、標的RNAの存在によって発光を示すという予備実験を行っていた。H30年度は二分割NanoLuc断片をタンデムにつないだものなどを作成し、もっとも高い発光能を示すものをスクリーニングした。その結果、N末端側断片、C末端側断片共に1つのみを有するプローブが、最も高いシグナル/ノイズ比を示した。この結果より、今後の実験ではRNA発光プローブとしてN末端側断片、C末端側断片共に1つずつを有するものを用いた。また、mPUMドメインは、過去の研究で実績のあるマウスβアクチンmRNAを標的とするものを用いた。
本プローブの遺伝子をマウス線維芽細胞株NIH3T3細胞にリポフェクションにて導入した。この細胞が示す発光値をマルチウェルプレートリーダーを用いて測定した。コントロールとして、標的RNAを有しないヒト由来HEK293細胞にプローブ遺伝子を導入したものも作製し、動揺に発光値を測定した。その結果、HEK293細胞と比較してNIH3T3の方が有意に高い発光値を示した。遺伝子導入効率はNIH3T3よりむしろHEK293細胞の方が高いことから、本プローブはNIH3T3内に存在する標的RNAを認識し発光を示していることを強く示唆している。続いてNIH3T3細胞にプローブ遺伝子を導入したものを発光顕微鏡を用いて観察した。その結果、プローブが発現した細胞において、細胞質に発光が確認できた。すなわち、顕微鏡下で1細胞より高解像度で標的RNAの可視化を実現した。
以上のように、H30年度はRNA発光プローブを開発し、1生細胞RNA可視化解析を実現した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

  • Research Products

    (10 results)

All 2019 2018

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (7 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 3 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Optical Control of G Protein-Coupled Receptor Activities in Living Cells2019

    • Author(s)
      Yoshimura Hideaki、Ozawa Takeaki
    • Journal Title

      Progress in Photon Science

      Volume: 119 Pages: 129~138

    • DOI

      10.1007/978-3-030-05974-3_7

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A robust split-luciferase-based cell fusion screening for discovering myogenesis-promoting molecules2018

    • Author(s)
      Li Qiaojing、Yoshimura Hideaki、Komiya Maki、Tajiri Ken、Uesugi Motonari、Hata Yutaka、Ozawa Takeaki
    • Journal Title

      The Analyst

      Volume: 143 Pages: 3472~3480

    • DOI

      10.1039/c8an00285a

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 分子動態解析による細胞内分子作動機構の解明-生細胞1分子イメージングによるアプローチ-2019

    • Author(s)
      吉村英哲
    • Organizer
      第95回創薬科学セミナー
    • Invited
  • [Presentation] Novel optical techniques to explore biological function in single cells2019

    • Author(s)
      Hideaki Yoshimura, Takeaki Ozawa
    • Organizer
      The 4th STEPS Symposium on Photon Science
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] A TECHNOLOGY FOR RNA LABELING IN LIVING CELLS TO MONITOR SINGLE-MOLECULE DYNAMICS UNDER FLUORESCENCE MICROSCOPY2018

    • Author(s)
      Hideaki Yoshimura, Takeaki Ozawa
    • Organizer
      Focus on Microscopy 2018
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 生細胞内RNA可視化プローブを用いた機能性RNAの1分子追跡2018

    • Author(s)
      吉村英哲、山田俊理、島田林太郎、小澤岳昌
    • Organizer
      第12回バイオ関連シンポジウム
  • [Presentation] 機能解析を志向した生細胞内RNAの1分子標識・動態分析法2018

    • Author(s)
      吉村英哲、山田俊理、江口正敏、島田林太郎、小澤岳昌
    • Organizer
      日本分析化学会第67年会
  • [Presentation] Analysis of real-time motion of signal transduction molecule Akt in living cells to reveal its functioning mechanism2018

    • Author(s)
      Hideaki Yoshimura, Takeaki Ozawa
    • Organizer
      第56回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] A single molecule imaging approach to understand signal transduction on the plasma membrane in living cells2018

    • Author(s)
      Hideaki Yoshimura
    • Organizer
      International Symposium on Nano Medicine 2018
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Book] 生命機能に迫る分子化学2018

    • Author(s)
      日本化学会
    • Total Pages
      204
    • Publisher
      化学同人
    • ISBN
      475981390X

URL: 

Published: 2021-01-27  

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