2016 Fiscal Year Annual Research Report
Estimation of metabolism activity for contractile single myotubes with pattern on the substrate
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16H04169
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
安川 智之 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 教授 (40361167)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 電気化学顕微鏡 / 単一細胞 / 酸素消費 / 酵素センサ / グルコース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，電気化学顕微鏡を用いて，単一筋管細胞の酸素消費速度およびグルコースの取り込み速度を同時に計測できるシステムを確立し，拍動する筋管細胞の酸素消費およびグルコース取り込み速度を測定することである．さらに，本手法が薬剤（糖尿病治療薬，代謝能改善薬等）のスクリーニングをハイスループット化できる計測システムを提案する．
まず，細胞の拍動に伴う酸素消費量計測を行った．電極を拍動する細胞近傍に設置し，酸素の還元電流をモニタリングすることにより，酸素消費速度を計測した．また，電気パルス刺激により基板上に培養された細胞を拍動させるためには，細胞培養液の液高さが重要であった．さらに，細胞を拍動させるための電気パルス強度を評価した．これにより，電気パルス刺激の印加時に，マイクロ電極にて酸素還元電流を計測することが可能となった．また，拍動誘発時にインスリン添加が必要であることがわかり，その濃度の最適化を行った．また，マイクロ電極をz軸方向に走査して細胞近傍の酸素濃度分布を捉えた．理論計算から単一筋管細胞の酸素消費速度を評価できた．現在，拍動している筋管細胞の酸素消費速度の定量を最優先で行っている．
また，筋管細胞アレイの作製を行った．PDMSステンシルを用いた筋芽細胞の培養を行い，分化後にステンシルを取り外して筋管細胞アレイを作製できた．この筋管細胞を電気パルスによる拍動させることに成功した．さらには，誘電泳動を用いた細胞アレイの作製に取り組み，個々の細胞の配置を可能にした．誘電泳動を利用したマイクロ電極への局所的酵素固定化法を開発し，デュアル電極のそれぞれに異なる酵素を固定化したデュアルマイクロ酵素センサの作製に成功した．また，電気化学的に均一サイズの酵素包括アルギン酸ゲルを作製する手法を開発し，高感度酵素センサ作製への材料として利用できることを示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究実施項目をほとんどすべて遂行することができた．さらには，当初予定研究以外にも成果が出ており学会発表が行われた．現在，筋管細胞の酸素消費，細胞のアレイ化およびデュアル酵素センサについての論文を準備中である．したがって，平成28年度に行われた研究は，当初の計画以上に研究成果を出ていると判断している．
電気化学顕微鏡による拍動する筋管細胞計測では，安定した細胞の拍動誘発と酸素消費量計測を達成しており，平成29年度以降，単一筋管細胞アレイやデュアル酵素センサとの融合により新たな展開が期待できる．これにより，これまで困難であった酸素，グルコース，乳酸の同時可能になり，本研究で提案する拍動に伴う単一細胞の代謝の連関評価が現実的となる．
当初予定していた研究以外の成果として，デュアルマイクロ酵素センサの開発がある．局所的なこの酵素修飾に微粒子を用いていたが，微粒子表面への酵素導入では酵素修飾量が少なく電流応答に問題があった．電気化学的に均一サイズの酵素包括アルギン酸ゲル粒子を作製することにより，修飾酵素量を増大させることに成功し，応答電流の増幅が可能となった．また，2つのマイクロ電極にグルコース酸化酵素および乳酸酸化酵素を別々に固定化することに成功し，局所領域においてグルコースと乳酸の濃度を経時的に同時モニタリングできることを示せた．このように，当初予定以上に感度と測定項目を達成できており，当初の計画以上に進展していることがわかる．
平成28年度は，電気化学顕微鏡による単一筋管細胞計測の探針となるデュアルマイクロ酵素センサの開発において大きな研究進展があり，今後の単一細胞の代謝の連関の評価体制を整えることができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度，単一筋管細胞の拍動時に細胞の呼吸活性が増加し，細胞近傍の酸素濃度が減少することを示した．また，拍動の周波数の増加に伴い酸素消費量が増加することを示せた．数本の筋管細胞で構成された細胞アレイを作製することができた．さらに，酵素修飾マイクログルコースセンサの作製を行ったところ，グルコース濃度の増加に伴う電流の増加が観測されmMから数十mMのグルコースを計測できることを示した．
平成29年度は，単一の筋管細胞アレイの作製とそのアレイ化細胞の拍動誘発を行う．さらに，拍動誘発した単一筋管細胞を対象に，拍動時の酸素消費およびグルコース取り込みを同時に評価する．細胞アレイのパターン精度の低下を防ぐため，誘電泳動法を組み合わせて迅速に筋芽細胞を細胞接着領域へと導き高精度な単一筋管細胞アレイの作製を行う．また，ガラス基板等の絶縁性基板上に培養した筋管細胞を，横方向からの電気パルスで拍動誘発する場合，溶液の厚さによって拍動効率が異なる．よって，多孔質膜上に細胞を培養し，縦方向に電気パルスを印加することにより高効率な拍動誘発を達成する．
デュアルマイクロ電極を作製し，片方の電極をグルコース酸化酵素で修飾する．前年度に得られたミクロンオーダーのアルギン酸微粒子の一括大量作製法を利用して酵素包括微粒子を作製し，正の誘電泳動法を用いて片側の電極にのみ多量の酵素を選択的固定化する．得られたデュアルマイクロ酵素電極を単一筋管細胞の直上に配置し，単一筋管細胞の拍動に伴う酸素消費とグルコースの取込みを調査する．筋管細胞を拍動させた時間と，酸素およびグルコース消費速度の連関を調査する．さらに，蛍光法を利用して細胞内へのグルコース輸送を担うGLUT4のトランスロケーション，インスリン受容体およびアセチルコリン受容体の分布を評価し，拍動時の酸素およびグルコース取り込みとの連関を評価する．
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Research Products
(37 results)
