2016 Fiscal Year Annual Research Report
新奇酵素、鉄硫黄フラボプロテイン・シトクロム脱水素酵素の分子機構の解明
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16H04175
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
早出 広司 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10187883)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 裕美 香川大学, 総合生命科学研究センター, 准教授 (10313305)
山崎 智彦 国立研究開発法人物質・材料研究機構, 機能性材料研究拠点ナノメディシングループ, 主幹研究員 (50419264)
津川 若子 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80376871)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 酵素 / 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / 生体分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
αγ複合体構造解析； 触媒サブユニット、αサブユニットとヒッチハイカープロテインであるγサブユニットとの複合体を調製し、これを結晶化した。その結晶構造解析の結果、同複合体において、αサブユニットに特徴的なCys残基が鉄硫黄クラスタを形成していることが観察された。また、αサブユニットにおけるFAD結合部位、γサブユニットとαサブユニットの会合面についてもその詳細な構造が明らかとなった。
触媒サブユニットにおける鉄硫黄クラスターの機能解明；αγ複合体についてESR解析を行ったところ、3Fe4S型の鉄硫黄クラスターに特徴的なスペクトルが観察された。この成果、およびこれまでの研究成果、さらに構造解析の結果を含め「鉄硫黄フラボプロテイン・シトクロム脱水素酵素」という新しい酵素タンパク質ファミリーの存在を提唱できた。
小サブユニットの酵素機能発現における役割の解明；γサブユニットにおいて、特徴的なCys残基に関する変異体を構築し、生産されるαγ複合体の酵素特性を検討したところ、触媒サブユニットの酵素活性は維持されるものの、その安定性が大幅に低下していることが観察され、γサブユニットはヒッチハイカープロテインとして機能しているだけでなく、触媒サブユニットの安定性にも関与していることが明らかとなった。
αγ複合体の電気化学的特性の解明； αγ複合体の野生型およびCysリッチ領域における変異体を酵素試料として作成した。しかし、同酵素の電子受容体との反応性が著しく低いことが判明し、この複合体の酸化還元電位を求めるには至らなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本グルコース脱水素酵素複合体の構造解析、ESR解析により、その触媒サブユニットに鉄硫黄クラスタが存在することを見出し、かつそれが3Fe4S型であることも見出した。また、これまでの類似タンパク質における触媒サブユニットと類推される配列中に今回解析に供したグルコース脱水素酵素と極めて保存性の高いCys繰り返し領域が見出されていることから、この鉄硫黄クラスタの存在はこれらの酵素では普遍的であることが証明できた。すなわち、本年度中に本研究の主な目的である鉄硫黄クラスタの存在を明らかにすることで、「鉄硫黄フラボプロテイン・シトクロム脱水素酵素」という新しい酵素タンパク質ファミリーの存在を提唱することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究成果はほぼ、予定通り進めることができた。唯一、鉄硫黄クラスタの酸化還元電位を解析することについて進捗が遅れている。当初はこの酸化還元電位測定については種々の電子受容体を用いることでの解析をめざしていたが、この複合体が電子受容体との反応速度がきわめて遅いことがこの困難さの原因である。今後はαβγ複合体酵素試料を中心として酸化還元電位の解析を進め、その中で鉄硫黄クラスタの酸化還元電位を推定することを試みる。
また、構造解析においてはαβγ複合体酵素試料を調製し、その結晶化を試みる。同酵素複合体は疎水性が高いことから、種々の界面活性剤を試すことで、適切な試料調製を試みながら結晶化をめざす。
同時にβサブユニット中に変異を導入することで、この電子伝達タンパク質内外での電子伝達の機構の解析を進める。
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| Remarks |
ドイツ・University SiegenのDr.Gilbert Noelは本課題の研究協力者として本酵素複合体の酸化還元電位計測に関する共同研究を実施する予定である。またアメリカ・Missouri State University, Assit.Prof. Keichi Yoshimatsu博士は、以前より本酵素の研究にかかわっており、論文投稿にあたり貴重な議論を提供し、論文投稿に貢献した。
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