2017 Fiscal Year Annual Research Report
ミトコンドリアを介した体内時計ニューロンの制御メカニズム
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16H04651
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
池田 真行 富山大学, 大学院理工学研究部(理学), 教授 (10288053)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 正明 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (80232198)
森岡 絵里 富山大学, 大学院理工学研究部(理学), 助教 (80756122)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 体内時計 / ミトコンドリア / 細胞内カルシウム / 時計遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、ヒト網膜モデル細胞（hRPE-YC細胞）を用いて、ヒトLETM1 shRNAの作用の評価を行い、Bmal1-luc発光リズムを、多チャンネルルミノメーターを用いて解析した。その結果、shRNA安定発現株のBmal1-lucレベルがscramble RNA安定発現株に比べて、有意に低下することが明らかになった。なお、以前に行ったラットC6細胞における解析結果は、細胞の増殖に対する間接的な作用であり、体内時計振動に対する作用ではないことも明らかとなった。よって、以後モデル細胞を用いた評価系では、hRPE-YC細胞を用いることとした。なお、hRPE細胞を用いて、ヒスタミン刺激（IP3/Ca2+シグナル）がBmal1転写リズムの1型位相反応を引き起こすことを報告した（Frontiers in Endocrinology 9: 108, 2018）。さらに、ヒスタミンによる細胞内Ca2+増加応答にもLETM1が関与する可能性も突き止めている。今年度はさらに、ラットSCNスライス培養に対し、遺伝子銃を用いてLETM1 shRNAおよびYellow Camereon3.6を強制発現させ、細胞内Ca2+リズムに対する影響を解析した。その結果、概日Ca2+リズムがLETM1ノックダウンにより長周期化することや、減衰することを観察した（日本時間生物学会発表）。また、これらの研究に加え、キイロショウジョウバエ時計ニューロンにおける細胞内Ca2+/H+リズムに対するLETM1ノックダウンの影響について解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究により、評価モデル細胞の確立に関し２編の国際原著論文（Scientific Reports 7: 44175, 2017; Frontiers in Endocrinology 9: 108, 2018）を発表しており、LETM1ノックダウンの影響を調べる技術基盤が確立したといえる。さらにラットSCNスライス培養を用いたニューロンレベルの研究も学会発表レベルまでデータを蓄積できている。キイロショウジョウバエ時計ニューロンにおける細胞内Ca2+/H+リズムに対するLETM1ノックダウンの影響を調べるために、昆虫脳組織のイメージング実験も進めており、GCaMP6センサーを用いた解析も順調に進んでいる。よって、研究全体の進捗状況は順調に推移しているものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、SCNスライス培養に対し、LETM1 shRNAおよびBmal1-lucを強制発現させ、分子時計振動に対する影響を解析する予定である。このため、初年度に導入した超高感度冷却EM-CCDカメラを用いて、Bmal1-luc由来の微弱発光の画像解析を進める予定である。また、hRPE-YC細胞を用いて、ミトコンドリアの形態や、ATP産生リズムに対するLETM1ノックダウンの影響を解析する予定である。特に、ライブセルにおけるミトコンドリアのダイナミックな形態変化や細胞内分布変化を共焦点動画として取得し、LETM1ノックダウンのミトコンドリアへの直接的な影響を詳細に分析する予定である。また、前年度に引き続きキイロショウジョウバエ時計ニューロンにおける細胞内Ca2+/H+リズムに対するLETM1ノックダウンの影響について調べる予定である。
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