Elucidation of super-undifferentiated state of mouse ES cells and application to reprogramming of ES/iPS cells of other species

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H04683
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 堀江 恭二 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ES細胞 / iPS細胞 / 再生医学 / 発生・分化 / 遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

我々は、蛍光蛋白Venusをレポーターに用いて、マウスES細胞で発現がON/OFFを繰り返す遺伝子を同定した。さらに、この遺伝子のON/OFFに応じて、ES細胞の細胞集塊の形態が変化することも見出した。これより、この遺伝子の発現の変動は、マウスES細胞の多能性の変動を反映する可能性が示唆された。さらに、Venusが 挿入されたゲノム領域には、類似の配列をもつ遺伝子がクラスターをなして存在することも見出し、このクラスター全体がES細胞の多能性を制御している可能性 も示唆された。
昨年度までの研究により、ES細胞におけるVenusの発現レベルに応じて、in vitro でのES細胞の分化能のみならず、キメラマ ウス作製時の個体への寄与率も異なることが明らかとなった。本年度は、この違いを生み出す分子機構を明らかにするために、Venusの発現レベルと相関してDNA結合活性が変動する転写因子群を、1細胞ATAC-seqを用いて同定した。同定した各転写因子を、ゲノム編集技術によりES細胞で破壊した結果、Venusの発現レベルに影響を与える転写因子を複数個特定できた。さらに、1細胞ATAC-seqの特性を生かして、1細胞レベルで互いに活性が相関する転写因子セットを同定し、複数の転写因子を同時にES細胞で破壊したところ、Venusの発現への影響がさらに増加するものや、逆に、影響が相殺されるものを同定できた。これらの知見から、ES細胞の未分化状態を制御する新たな転写因子ネットワークを推察できた。
また、以前から、Venusの挿入部位に存在する2Mbの遺伝子クラスターの欠失を試み、片アレルのみ欠失したES細胞株を単離していたが、新たにターゲティングベクターを構築してゲノム改変を継続した結果、PCR解析レベルにおいて両アレルともに遺伝子クラスターが欠失したと考えられるES細胞を取得した。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Presentation] Identifying the heterogeneity of ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells and elucidating its regulatory mechanism (2019)
  • Author(s): Kyoji Horie, Hitomi Watanabe, Yosuke Nishimura, Hikaru Watanabe, Masahide Seki, Akio Seita, Kagayaki Kato, Yuichi Wakayama, Jun Sese, Yutaka Suzuki, Takuji Yamada, Gen Kondoh, Junko Yoshida
  • Organizer: 第42回日本分子生物学会年会
  • Invited