2016 Fiscal Year Annual Research Report
長鎖ncRNAが担うTGF-β経路の新規調節機構とがん細胞の運命制御
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16H04696
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ノンコーディングRNA / 上皮間葉転換 / TGF-beta |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、我々が同定したTGF-betaによって誘導される新規長鎖ncRNA(lncRNA) ELIT-1を介した TGF-beta経路の新規制御機構と生理機能の解明を目指している。興味深いことにELIT-1をノックダウンすると上皮間葉転換(EMT)が抑制されることがわかった。今回我々はTGF-betaによるELIT-1の誘導機構を詳細に解析した。肺がん細胞株A549ではTGF-beta刺激後４時間という早期にELIT-1の誘導が開始することがわかった。この誘導はSmad3の阻害剤SIS3で阻害されたが、非Smad経路の阻害剤では抑制されなかった。また、ELIT-1プロモーターのレポーターassayでも同様であった。また、TGF-beta刺激によりELIT-1プロモーターのSmad結合部位にSmad3が結合することがChIP-assayで判明した。これによりTGF-betaによるELIT-1の誘導はSmad3を介したcanonical経路であることが判明した。この時点で、TGF-betaによるELIT-1遺伝子の発現がSmad3だけで調節されているのかさらに解析する必要が生じた。そこで、ELIT-1遺伝子がエピジェネティックな制御を受けているかChIP-assayで解析したところ、TGF-betaによりELIT-1プロモーター領域のヒストンH3リジン27のメチル化が低下していることが示唆された。ヒストンH3リジン27のメチル化は抑制マークであるので、それが低下することがTGF-betaによるELIT-1遺伝子の発現に寄与している可能性が示唆され、さらなる検証と分子機構の解析が必要となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
H28年度はTGF-betaによるELIT-1の誘導機構をはじめに行い、終了後に上皮間葉転換(EMT)制御におけるELIT-1の機能解析を行う予定であった。ELIT-1の誘導機構については、Smad3の阻害剤SIS3で阻害されたが、非Smad経路の阻害剤では抑制されなかった。また、TGF-beta刺激によりELIT-1プロモーターのSmad結合部位にSmad3が結合することがChIP-assayで判明した。これによりTGF-betaによるELIT-1の誘導はSmad3を介したcanonical経路であることを見いだし、この点についての目標は達成した。しかしながら、TGF-betaによるELIT-1遺伝子の発現がSmad3だけで調節されているのかさらに解析する必要が生じた。ChIP-assayで解析したところ、TGF-betaによりELIT-1プロモーター領域のヒストンH3リジン27のメチル化が低下していることが示唆され、それについてのさらなる検証と分子機構の解析が必要となり、H29年度に計画を繰り越した。上皮間葉転換(EMT)制御におけるELIT-1の機能解析についてはこのエピジェネティックな制御の解析が終わってからとなり、予定変更を余儀なくされた。よってやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
TGF-betaによるELIT-1誘導のエピジェネティックな制御の解析については、ELIT-1プロモーター領域のヒストンH3リジン27のメチル化の詳細な解析を行なうとともに、TGF-betaによりヒストンH3リジン27のメチル化が如何にして低下するかについて解析する。特にヒストン脱メチル化酵素、ヒストンメチル化酵素に注目して解析する。続くEMT制御におけるELIT-1の機能解析については、ELIT-1の標的遺伝子(N-カドヘリン、ビメンチン等)の発現誘導がSmad3に特異的であるかレポーター-assayや ChIP-assay等を持いて検証する。そしてさらに如何にしてELIT-1が標的遺伝子の発現をSmad3依存的に増強するのか、その分子機構の実体について解析する予定である。また、他のELIT-1の標的遺伝子の制御についても同様なメカニズムで誘導するのかについても解析する。
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