2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel molecular diagnostic and therapeutic tools based on genomic information of malignant mesothelioma
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16H04706
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| Research Institution | Aichi Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
関戸 好孝 愛知県がんセンター(研究所), 分子腫瘍学部, 副所長兼部長 (00311712)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村上 優子 (渡並優子) 順天堂大学, 臨床検査医学講座, 准教授 (70405174)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ゲノム解析 / 悪性中皮腫 / 遺伝子 / シグナル伝達 / トランスレーショナルリサーチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性中皮腫のゲノム異常の主体であるがん抑制遺伝子の変異に着目して研究を進めた。特にNF2遺伝子が制御するHippoシグナル伝達系の調節異常に着目した。NF2-Hippoシグナル伝達系の不活性化は転写コアクチベーターであるYAP1の恒常的な活性化を引き起こすが、そのホモローグであるTAZに着目して検討した。TAZの発現および脱リン酸化(活性化）状態を悪性中皮腫パネル(23株）を用いて検討したところ、多くの細胞株で活性化が認められ、YAPよりTAZの活性化状態が上回っている細胞株も明らかにされた。さらに、TAZの発現ベクター（野生型、活性型）およびshRNAを作成し、細胞内への導入効率を検討した。TAZの恒常的活性型変異体（TAZ-S89Ａ）を不死化中皮細胞株に導入したところ核内集積が確認され、活性化状態にあることを確認した。さらに活性型TAZS89Aは細胞増殖能を亢進させる予備的な結果を得た。
合成致死に関してはゲノムワイドのプール型レンチウィルスライブラリーを用いて、悪性中皮腫の原因遺伝子（NF2, LATS2, BAP1等）変異に対して合成致死表現型を示す遺伝子を網羅的に探索した。解析の結果、得られた候補遺伝子に対して個別にノックダウンして再現性を検討した。その結果、BAP1変異に対してはDNA修復に関連する因子、LATS2変異に関してはRNA代謝に関わる因子が候補として抽出された。BAP1変異に関しては、培養細胞での表現型、足場非依存性増殖条件下での表現型の再現、阻害剤での表現型の再現を確認した。LATS2変異に関しては、培養細胞での表現型の確認とともにLATS2キナーゼ下流のHippo経路に関しても同様の表現型を示すことが予備的に確認された。また、候補遺伝子産物に対する阻害剤を探索するためにインシリコスクリーニングを行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
悪性中皮腫はがん抑制遺伝子の変異が主体であるため、個別のがん抑制遺伝子異常がもたらす細胞内シグナル伝達系の変化とそれに対する依存状態（Addiction）の特徴の理解、および合成致死の表現型の探索を行うことが極めて重要と考えている。
我々のグループではNF2-Hippoシグナル伝達系の不活性化により、転写コアクチベーターであるYAPの恒常的活性化と悪性形質の増強を今まで明らかにしてきたが、YAPのホモローグであるTAZも同様に恒常的に活性化していることが示唆され、TAZについて今後詳細に検討することが重要であると考えられた。悪性中皮腫細胞におけるTAZの機能解析は順調に開始されたものと考えられる。
合成致死表現型に関する検討は、研究を担当する村上（分担研究者）が愛知県がんセンターから順天堂大学へ異動したため、その間、進捗はやや遅れたが、異動後、研究を再開することができた。スクリーニングによって得られた候補遺伝子を個別にノックダウンして検討した結果、BAP1変異に関してはDNA修復に関連する因子、LATS2変異に関してはRNA代謝に関する因子が明らかとなり、これらについて重点的に取り組むこととした。BAP1変異に関しては、阻害剤でも表現型を再現できること、足場非依存性増殖でも再現できることなど、担がんマウス実験に繋がるデータを蓄積した。LATS2変異に関しても、培養レベルで同様の表現型を示すという予備的な結果を得た。LATS2変異に対する候補遺伝子の阻害剤は存在しないため、インシリコスクリーニングを試み、得られた阻害剤の候補をいくつか試したが、現在のところ、同様の表現型を示すものは得られていない。そのため、LATS2に関しては、今後、別のアプローチが必要と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も悪性中皮腫において高頻度に不活性化しているNF2, BAP1といったがん抑制遺伝子異常を中心に検討を進めていく予定である。NF2変異に関しては、Hippoシグナル伝達系が制御するTAZ転写コアクチベーターに関して、TAZ遺伝子の不死化中皮細胞株への遺伝子導入、悪性中皮腫細胞に対するノックダウン実験をin vitro、in vivoレベルで行う。細胞増殖能の変化やその他の悪性形質の獲得に関して検討する。さらに、TAZが制御する遺伝子群で重要な遺伝子を同定し、それを制御することにより、NF2-Hippo伝達系が不活性化した悪性中皮腫細胞株の増殖を阻害することが可能かどうか検討する。
BAP1変異に関しては、分子機構の詳細な解析を進めるとともに、担がんマウスを用いた表現型の確認を行う。その際、阻害剤および膜透過性核酸を用いる予定である。LATS2変異に関しては、分子機構の詳細な解析を進めるとともに、足場非依存性増殖での表現型を確認し、担がんマウスでの表現型の確認につなげる。また、前年度行ったインシリコスクリーニングとは別の、より効果的に目的化合物が得られると考えられるインシリコスクリーニングを再度行い、得られた候補化合物から合成致死表現型を示す阻害剤の同定を試みる。
NF2変異, SETDB1変異, SETD2変異に関しては、スクリーニングの結果から個別のノックダウンを行うことで集中して解析を行う候補遺伝子の確定を試みる。また、いずれの変異に対しても、公開されているがん患者の発現データおよび予後データを再解析する事でヒト個体においてもそれらの表現型が保存されていることを確認する。
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