2016 Fiscal Year Annual Research Report
癌幹細胞性を担うPRDM14分子の蛋白質相互作用に基づく機能解明と抗腫瘍薬の開発
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16H04710
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
谷口 博昭 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (90563289)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長門石 曉 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (30550248)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 薬学 / 遺伝子 / トランスレーショナルリサーチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
PRDM14遺伝子産物の発現そのものを抑制する核酸医療を展開し非臨床試験を実施中であり、副作用なく高い抗腫瘍効果が認められている。非常に特異性の高い治療法で副作用は皆無であるが、低分子化合物のコストと比較した場合、高額となるのは否めない。
そこで視点を変えて、最終的に低価格の低分子化合物（抗腫瘍薬）の開発に繋がる基礎研究を計画した。すでに、PRDM14遺伝子産物のがん細胞における分子生物学的特性を解析してきたが、本分子ががん細胞内で抗がん剤耐性、転移能、幹細胞性を発揮する際に、プレリミナリーであるが蛋白質複合体を形成していることが判明した。
そこで、東京大学創薬機構で展開されているタンパク質相互作用 (PPI: Protein Protein Interaction) に着目した創薬手法をもって追求することが理想的と考え、PRDM14遺伝子産物とPPIを形成する蛋白の同定に立脚したPRDM14遺伝子産物の分子機能の詳細な解明、及びその知見を応用した難治性乳がん、膵臓がんを対象としたPRDM14遺伝子産物とのPPIを阻害する薬剤（新規の抗腫瘍低分子化合物）の開発基盤の樹立を目指して研究を推進した。初年度の目標は、PRDM14遺伝子産物と相互作用する有望な遺伝子産物を候補の中より同定することにある。
PRDM14遺伝子産物と相互作用するタンパク質のスクリーニング試験をLC-MS法により行い候補遺伝子産物が得られた段階であった。その候補より高性能表面プラズモン共鳴を用いて、市販されている全長蛋白（一部、partial）を使用し、候補遺伝子産物の絞り込みをほぼ終えた。生細胞内蛋白質相互作用の検出による絞り込みをBRET (Bioluminescence RET) 法を用いて行い、高性能表面プラズモン共鳴で同定した候補と比較し、ほぼ一致する結果が得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PRDM14遺伝子産物と相互作用するタンパク質のスクリーニング試験をLC-MS法により行い候補遺伝子産物が得られた段階であった。その候補より高性能表面プラズモン共鳴を用いて、市販されている全長蛋白（一部、partial）を使用し、候補遺伝子産物の絞り込みをほぼ終えた。生細胞内蛋白質相互作用の検出による絞り込みをBRET (Bioluminescence RET) 法を用いて行い、高性能表面プラズモン共鳴で同定した候補とほぼ一致する結果が得られた。
高性能表面プラズモン共鳴により結合の強さが定量的に得られ、また、BRET法は結合強度は遺伝子産物間で比較し難いが、特筆すべきは細胞内での阻害剤スクリーニングの最適化が容易である。さらに、詳細な結合部位の同定は構造決定が前提となるが、PRDM14の全長蛋白以外に、PRDM14の欠損体を作成し、それを使用することで大まかな結合可能性部位の推測を行った。
得られた成果として、具体的には、ポリコーム遺伝子群、乳がん・膵臓がんに関連する遺伝子産物、遺伝子の転写産物を調節する系に関連する遺伝子産物が絞り込まれている。特に、ポリコーム遺伝子群に関連する蛋白に関しては、研究分担者と共にPRDM14と相互作用する確実性の高い蛋白産物を同定した。
当初計画には無かったが、さらに進捗した点としては、プロテインアレイ法で9万遺伝子産物の中より、PRDM14（全長）と結合する可能性が高い新規の候補遺伝子産物が得られたため、上記の系での検証を次年度に追加で予定している。また、次年度に標的遺伝子産物の蛋白が大量に必要となることから、研究分担者とPRDM14及び候補遺伝子産物の大量合成系の樹立に向けて系の最適化を目下推進中である。特にPRDM14は分解されやすい蛋白質であり、分担研究者の研究を背景に次年度には大量合成の系が樹立される可能性が高い状況にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
大きな研究の柱は、相互作用を阻害する化合物のin vitro及びin cellスクリーニングを開始し一定の化合物候補を抽出することにある。前年度に樹立したBRET法により、東京大学創薬機構の低分子化合物ライブラリーの化合物を活用することで化合物候補を拾い上げ、そのコンファームに高性能表面プラズモン共鳴法と低分子化合物ライブラリーの組み合わせでの検証を経ることにより、候補を絞り込む計画である。
その前提となるのが、PRDM14及び候補遺伝子産物の大量合成系の樹立に向けて系の最適化、であり、上半期に大量合成系が樹立される計画である。また、当初予定にはなかった、プロテインアレイ法で新規の候補遺伝子産物が得られたため、候補遺伝子産物について前年度と同じ手法で検証するためのベクター構築、小スケールでの蛋白質合成を行う予定である。また、ポリコーム遺伝子群以外に同定された遺伝子産物に関しての詳細な検証を進める。
上記のスクリーニングの後、PRDM14遺伝子産物との相互作用を阻害する低分子化合物のin vitro, in vivo評価に進む。「PRDM14遺伝子産物の相互作用を阻害する化合物のin vitro及びin cellスクリーニング」で得られた化合物を実際のがん細胞株を用いてviability testを行う。PRDM14遺伝子産物ががんの転移、浸潤、抗がん剤耐性を担うことはすでに先行研究で明らかとしているところであるので、得られた化合物ががんの浸潤能、抗がん剤耐性に与える影響を多角的にin vitroで評価する。その中でさらに化合物が絞り込まれると考えられる。その後、nude mouseを用いてin vivoでの候補化合物の造腫瘍能に与える影響、肺転移、肝転移モデルを使用して候補化合物が腫瘍の転移能に与える影響を評価する。
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[Journal Article] Structural basis for amino acid export by DMT superfamily transporter YddG2016
Author(s)
Tsuchiya H, Doki S, Takemoto M, Ikuta T, Higuchi T, Fukui K, Usuda Y, Tabuchi E, Nagatoishi S, Tsumoto K, Nishizawa T, Ito K, Dohmae N, Ishitani R, Nureki O.
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Journal Title
Nature
Volume: 534
Pages: 417-420
DOI
Peer Reviewed
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