Novel therapy against human cancers using intra-nuclear transportable humanized monoclonal antibody against CD26.

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H04714
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 山田 健人 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60230463)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 睦 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (60327575) ; 西田 浩子 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (80317130)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 抗体療法 / 抗体薬物複合体 / 核移行 / CD26 / RNAポリメラーゼII

Outline of Annual Research Achievements

CD26は多種類のヒトがんにおいて高発現している。これまでヒト化抗CD26モノクローナル抗体の開発を通じて、本抗体がCD26をがん細胞膜表面から核内に移行させ、核内CD26がRNAポリメラーゼIIサブユニット（POLR2A）の転写を抑制し細胞増殖を阻害すること、この核移行と増殖阻害ががん細胞特異的であることを報告した。さらに抗がん分子を本抗体に結合させ核内で抗がん効果を発揮させる方法を開発した。そこで本研究では、１）がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明、２）がん組織検体におけるPOLR2A遺伝子欠失と相関するバイオマーカーの開発、３）本抗体とPOLR2A阻害剤の結合による分子標的療法の開発、を行っている。その結果、１）POLR2A転写調節領域でCD26／抗体と会合する分子の候補として3分子を見出し、これらの分子の正常細胞とがん細胞での発現・機能の解析を進めており、２）がん組織において17p13領域およびp53遺伝子とPOLR2A遺伝子の欠失があった同一腫瘍でRNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の発現解析を行い、数種類のバイオマーカーの候補分子を見出し、３）RNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の阻害分子をヒト化抗CD26抗体へ結合し、in vitro, in vivoでの抗がん活性を明らかにした。本抗体は、通常の免疫機構を介した抗がん作用のみならず、増殖抑制や浸潤・運動阻害などの直接的な抗がん作用を有すことから、抗体-薬剤複合体(Antibody-Drug Conjugate;ADC)にすることで、さらに相加・相乗的な効果が期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１）がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明：ヒト肝癌細胞株HCC-1, 肺腺癌細胞株A549の核抽出・細胞質成分からCD26の免疫沈降を行い、CD26結合蛋白を単離、質量分析、アミノ酸配列決定した。現在、核移行シグナルを有する候補として、Transportin 1など3種類を見出し免疫沈降によりCD26との会合を確認した。またPOLR2A転写調節領域でCD26／抗体と会合する分子を探索すべく、ヒト中皮腫細胞株JMNのライブラリーを作成し、核移行シグナルを有するもの、およびデータベース上、核内にその存在があるものとしてNUP214など数種類を見出し免疫沈降法によりCD26との会合を確認した。
２）がん組織検体におけるPOLR2A遺伝子欠失と相関するバイオマーカーの開発：p53・POLR2A遺伝子ともに野生型および両遺伝子ヘテロ欠失型の大腸癌細胞株を用いて、17p13領域、p53およびPOLR2A遺伝子の欠失構造を解析し、RNAポリメラーゼII構成分子群(RBP1(POLR2A), RBP2 - 12)および基本転写因子群(TFIIA, B, D, F, H)に対する抗体を用いた免疫染色およびFISH法を行った。その結果、RBPの一部とTFIIHが発現低下していることを見出した。
３）本抗体とRNAポリメラーゼII阻害剤の結合による分子標的療法の開発：RNAポリメラーゼII構成分子および基本転写因子に対する阻害分子（α-amanitinおよびtriptolide）をリンカーを用いて抗CD26抗体へ結合させ精製した。精製した結合分子の中で、抗体とtriptolideの結合分子はin vitro, in vivoででの抗がん活性を発揮することを見出した。

Strategy for Future Research Activity

１）がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明
免疫沈降により得られたCD26結合蛋白で核移行シグナルを有する候補分子について、YFP融合蛋白としCD26-CFP蛋白とともにFRET法により細胞内局在・輸送経路を観察し、核内でFRET陽性となる分子について、がん細胞における発現解析を行う。上記の蛍光分子の1分子観察法にて核輸送経路を詳細にする。CD26／抗体複合体とがん細胞核内で会合する候補分子から、POLR2A転写調節に関わる分子を同定し、CD26および候補分子の変異体を用いて、構造機能解析を行い、ヒトがん組織での発現や局在を検討し、臨床病理学的パラメーターとの関連を探る。
２）がん組織検体におけるPOLR2A遺伝子欠失と相関するバイオマーカーの開発
RNAポリメラーゼII構成分子群および基本転写因子群の免疫染色を継続し、がん組織においてPOLR2A遺伝子欠失を免疫染色にてスクリーニングしうるバイマーカーを探索する。がん組織において、17p13領域、p53およびPOLR2A遺伝子についてFISH法の検討を行い、ヘテロ欠失を鋭敏に検出できる方法を確立する。
３）本抗体とRNAポリメラーゼII阻害剤の結合による分子標的療法の開発
α-amanitinおよび基本転写因子群に対する各種阻害分子（minnelide, THZ1）をヒト化抗CD26抗体へ結合させ、抗体価が維持され、かつRNAポリメラーゼII阻害効果があり、毒性が低いADCを開発する。得られた結合分子は、アフィニティカラムにてIgG1とし精製し、血中のエステラーゼ等での分解や、その安定性を試験管内およびマウス体内で検討する。また細胞内での抗体と薬剤の分離能について細胞分画法により検証し、 様々な分離を示すADCを目指す。

Research Products

• [Journal Article] Signaling between pancreatic beta-cells and macrophages via S100 calcium-binding protein A8 exacerbates beta-cell apoptosis and islet inflammation. (2018)
  • Author(s): Inoue H, Shirakawa J, Togashi Y, Tajima K, Okuyama T, Kyohara M, Tanaka Y, Saisho Y, Yamada T, Shibue K, Kulkarni RN, Terauchi Y
  • Journal Title: The Journal of Biological Chemistry Volume: 293 Pages: 5934-5946
  • DOI: 10.1074/jbc.M117.809228.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A novel phenylphthalimide derivative, pegylated TC11, improves pharmacokinetic properties and induces apoptosis of high-risk myeloma cells via G2/M cell-cycle arrest. (2017)
  • Author(s): Aida S, Hozumi M, Ichikawa D, Iida K, Yonemura Y, Tabata N, Yamada T, Matsushita M, Sugai T, Yanagawa H, Hattori Y
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 493 Pages: 514-520
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.08.159.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pancreas fat and beta cell mass in humans with and without diabetes: An analysis in the Japanese population. (2017)
  • Author(s): Murakami R, Saisho Y, Watanabe Y, Inaishi J, Tsuchiya T, Kou K, Sato S, Kitago M, Kitagawa Y, Yamada T, Itoh H.
  • Journal Title: The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism Volume: 102 Pages: 3251-3260
  • DOI: 10.1210/jc.2017-00828.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] PEG(E)-TC11, a novel polyethylene glycol-linked phthalimide derivative, inhibited high-risk MM cell growth in vivo and in vitro via cell cycle G2/M arrest in a CRBN-independent manner. (2017)
  • Author(s): Aida S, Ichikawa D, Iida K, Hozumi M, Nakamura M, Uozaki R, Hashimoto N, Okayama M, Yonemura Y, Tabata N, Yamada T, Matsushita M, Sugai T, Yanagawa H, Hattori Y
  • Organizer: American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting (Washington D.C., USA)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Anti-tumor effects of humanized anti-CD26 monoclonal antibody against hepatocellular carcinoma. (2017)
  • Author(s): Yamada T, Madokoro H, Yamada K, Nishida H, Morimoto C, Sakamoto M, Hayashi M.
  • Organizer: 第106回日本病理学会総会（東京）
• [Presentation] Humanized anti-CD26 monoclonal antibody has a therapeutic potentiality against multiple myeloma. (2017)
  • Author(s): Nishida H, Hayashi M, Morimoto C, Sakamoto M, Yamada T.
  • Organizer: 第79回日本血液学会総会（東京）
• [Presentation] The regulation of pruritus in psoriasis and atopic dermatitis-a possible role for CD26/DPPIV (2017)
  • Author(s): Komiya-Suyama E, Hatano R, Ostuka H, Itoh T, Yamazaki H, Suga Y, Kimura U, Yamada T, Tominaga M, Takamori K, Ohnuma K, Morimoto C
  • Organizer: 9th World Congress on Itch (Wroclaw, Poland)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Anti-CD26 humanized monoclonal antibody conjugated to triptolide is transported into nucleus and impairs RNA polymerase II. (2017)
  • Author(s): Yamada T, Madokoro H, Nishida H,Morimoto C,Sakamoto M, Hayashi M.
  • Organizer: 2017年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）（神戸）
• [Presentation] IL-26 facilitates angiogenesis and skin inammation via inducing FGF2 production in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. (2017)
  • Author(s): Itoh T, Hatano R, Otsuka H, Iwao N, Iwata S, Yamada T , Morimoto C.
  • Organizer: The 46th Japanese Society for Immunology（仙台）
• [Presentation] Humanized anti-CD26 monoclonal antibody, YS110, has anti-myeloma efficacy for the treatment of high-risk multiple myeloma (2017)
  • Author(s): Nishida H, Hayashi M, Morimoto C, Sakamoto M, Yamada T.
  • Organizer: the 59th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition. (Atlanta, USA)
  • Int'l Joint Research