2016 Fiscal Year Annual Research Report

C. elegans最近縁種のゲノム、形態発生、生態解析に基づく比較進化研究

Research Project

Project/Area Number	16H04722
Research Institution	University of Miyazaki
Principal Investigator	菊地泰生宮崎大学, 医学部, 准教授 (20353659)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	神崎菜摘国立研究開発法人森林総合研究所, その他部局等, 主任研究員等 (70435585) 杉本亜砂子東北大学, 生命科学研究科, 教授 (80281715)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	C elegans / 姉妹種 / 比較ゲノム / 種分化
Outline of Annual Research Achievements	長らく求められてきたC. elegans の姉妹種を石垣島のイチジクから発見した。この線虫(sp.34)はC. elegans の最近縁種であるにもかかわらず、C. elegans の約2 倍の体サイズをもち、C. elegansとは全く異なる生殖様式や生態を有している。これはsp.34 がEvoDev、比較生態、比較ゲノム研究などに最適な材料であることを意味し、まさに多くの研究者が長年求めてきた材料である。本研究では、sp.34 線虫の高品質なリファレンスゲノムを構築し、C.elegans との比較ゲノム解析を行う。さらに、詳細な形態、発生、生態の観察に基づきC. elegans とのphenotypicな違いを明らかにし、遺伝学研究ツールを開発・活用することで遺伝子機能も含めたシステマティックな比較解析を行う。これら一連の研究を通して、これまでにない比較進化学研究プラットフォームを構築することを目的とする。本年度は新種記載のために、C. sp34線虫の詳細な形態観察（光学顕微鏡および電子顕微鏡観察）と基礎生物学的解析（成長速度や培地指向性、ボディーサイズ変化等）、比較ゲノム解析のためのリファレンスゲノムの構築、および遺伝学研究ツールの開発に向けたRNAiの試行、トランスジェニック作成を行った。リファレンスゲノムの構築には複数のシーケンシングテクノロジー（イルミナ、PacBio）によるハイブリッドアセンブリを試み高品質なゲノムアセンブリを獲得した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 新種記載のための形態観察を顕微鏡下で行い、新種記載に必要な雌雄別の形態数値と画像、イラストの作成を行った。培地とバクテリア餌を検討し、最適な培養法を確立した。リファレンスゲノム構築のためDNAを抽出し、2タイプの次世代シーケンサー（PacBioとIllumina）でDNAリードを獲得した。獲得したDNAリードのアセンブルを行い、配列のエラーコレクションを行って1版のゲノムアセンブリーを構築した。また、遺伝学研究ツールの開発に向けてRNAiのソーキングやフィーディング法の試行を行い、発現部位の異なる遺伝子に対する有効性を検討しRNAiがツールとして本線虫に有効であることを確認した。トランスジェニックの作成をマイクロインジェクションを用いて行い、C. elegansと同程度の効率でトランスジェニックが作成できることを確認した。
Strategy for Future Research Activity	１．形態観察と基礎生物学的解析：新種記載のために必要な部位については走査電子顕微鏡での撮影を行う。ライフサイクルを確定させるためにラボ内での成長速度、至適温度、オスメス比、耐久型幼虫の出現傾向を観察する。２．比較ゲノム解析：オプティカルマップを使用し、次世代シーケンサー（PacBioおよびIllumina）で作成したアセンブルを改良する。作成したリファレンスゲノムに対し遺伝子予測を行い遺伝子モデルセットを獲得する。遺伝子予測に利用するRNAseqをメス、オス、幼虫から抽出したRNAを用いて獲得する。３．遺伝学的研究ツールの開発：C. elegansで利用されている抗C.elegansタンパク質抗体を用いてC. sp34線虫の抗体染色を行い、C.elegansの膨大な抗体セットがsp34で利用可能性を検証する。CRISPR-cas9系によるトランスジェニック、遺伝子破壊株の作成手法を本線虫のために最適化し、使いやすいツールとして確立する。雌雄同体のC. elegansと異なり雌雄異体であるため、株の確立には工夫が必要である。