2017 Fiscal Year Annual Research Report

リング状AAA型シャペロンの基質への作用機構のin vitro系による解明

Research Project

Project/Area Number	16H04764
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	小椋光熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (00158825)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	江崎雅俊熊本大学, 発生医学研究所, 助教 (70437911) 山中邦俊熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (90212290)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	分子シャペロン / タンパク質分解 / タンパク質の品質管理 / プロテアソーム / 神経変性疾患
Outline of Annual Research Achievements	AAA型シャペロンp97（ヒトではVCP、線虫ではCDC-48、酵母ではCdc48）の作用機構を明らかにする目的で遺伝生化学的解析を行い、以下のことを明らかにした。酵母のM228Y変異Cdc48と20Sプロテアソームから構成される新規プロテアソームの存在を遺伝生化学的手法により証明した（Esaki et al., 2017）それにより分解されるいくつかの細胞内基質候補を同定した。そのうちの１つはSod1 (superoxide dismutase)であった（Esaki et al., 2017）。精製標品によるin vitro再構成系においてSod1がM228Y変異Cdc48-20Sプロテアソームにより、ATP依存的に分解されることを明らかにした。今後このin vitro反応系を用いて、詳細な分子機構を解明する。ヒトにおいて、VCP及びSod1の変異により筋萎縮性側索硬化症（ALS）を発症することが知られており、今後p97-20SプロテアソームによるSod1の分解がALSと関連するかどうかを明らかにすることは興味深い。リボソーム品質管理（RQC）におけるp97の機能を解析するため、RQCに関与するp97のアダプタータンパク質を酵母で網羅的に探索したところ、これまでに同定されていたUfd1-Npl4ヘテロダイマーに加え、Ufd2が同定された。また、アダプターではないが、シャトル因子Rad23も効率的なRQCに必要であることを明らかにした。これにより、RQCのin vitro再構成に必要な因子が同定できたので、これらの因子の精製を始めた。ヒトp97ホモログVCPによるTDP-43アミロイド線維の脱凝集解析は、アミロイド線維の形成条件の検討が不十分で、解析に使用できる線維が得られていないため、in vitro解析に至っていない。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 新規プロテアソームp97-20Sプロテアソームの存在を証明し、これによるin vitro基質分解系の確立にほぼ成功したので、これを用いて、種々の解析が可能となった。そこから、神経変性疾患ALSの発症機序にも新たな知見が得られる可能性が出てきた。また、リボソーム品質管理機構に関わる因子の同定が終了し、すべての因子の精製に着手している。
Strategy for Future Research Activity	新規プロテアソームp97-20Sプロテアソームによるin vitro基質分解系を用いて、種々の基質の分解について解析する。基質及びp97の変異による分解効率の変化などから、p97の機能を解明する。また、基質の1つSod1の分解効率・様式から、神経変性疾患ALSの発症機序の手掛かりを得る。リボソーム品質管理機構に関わるすべての因子の精製に着手しているので、これらを用いたin vitro再構成系の確立をめざす。ただし、その再構成系が機能しないときは、個々の因子の相互作用などについて解析し、分子機構の解明を図る。ヒトp97ホモログVCPによるTDP-43アミロイド線維の脱凝集解析は、アミロイド線維の形成条件の検討が不十分で遅れているが、条件検討を済ませ、実施する。全体として、計画の大きな変更はない。