2016 Fiscal Year Annual Research Report
Study of crosslinked and stabilized microtubules
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16H04765
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
鈴木 厚 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (00264606)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 郁子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (80464527)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 微小管 / コイルドコイル / 架橋 / 微小管安定化 / プルキンエ細胞 / EB1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)N末端微小管結合領域に関する解析：N末端の微小管結合領域の会合に、コイルドコイル領域1番が決定的な役割を果たしていることを明らかにすると共に、この結果に基づいて、このN末端が微小管の安定化を引き起こすことなく微小管を架橋しうることを最終的に確認した。さらに、MTCL1の会合に必須な領域をすべて同定することに成功し、コイルドコイル領域の2番が会合活性を持たない一方で、C末端の非コイルドコイル領域に他のタンパク質を介した予想外の分子会合領域が存在するという興味深い発見をした。また、十分な量と精製度を持った全長タンパク質の精製にはいまだ成功していないものの、最も会合に重要なN末端のコイルドコイル領域の精製には成功し、この領域が2量体を形成していることを示す結果を得た。これらの結果をまとめた論文を投稿し、これまで想定していなかったようなMTCL1の分子会合モデルを提唱した。
(2)C末端微小管結合領域に関する解析：本領域の塩基性アミノ酸が微小管結合に必須であることを明らかにすると共に、脊髄小脳変性症の患者さんに見出された変異の解析から,この領域の微小管結合と微小管の安定化活性が切り分けられることを示す結果を得た。これらの結果により、C末端の微小管安定化機構の解明に大きな手がかりを得ることに成功した。一方、この領域の組換えタンパク質を大腸菌から純度高く精製する方法を大きく改善し、「X線線維回折」実験を進める準備をほぼ整えた。また、上記(1)の会合状態の解析実験の結果から、N末端とC末端の微小管結合領域が協調的に働いている可能性が明らかとなり、その点に関する新たな研究の必要性が浮き彫りとなった。
(3)AIS微小管束制御メカニズムの解析：MTCL1ノックアウトの解析をほぼ完了し、論文発表に至った。一方、小脳プルキンエ細胞におけるEB1の組織染色条件の確立に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MTCL1分子全長（野性型、変異体）や、C末端微小管結合領域の精製については、並行して進めていた研究課題の想定外の展開もあって、十分な力を割くことが出来ず、28年度以内に精製を完了して解析に進むことができなかった。しかし、後者については基本的な精製法の確立までは進んでおり、前者については論文投稿を済ませたおかげで、今後、集中して取り組む条件がうまれている。こうした状況を鑑みるならば、本来の目的に向かって着実に研究を進めることができていると評価できる。
マウス個体レベルの実験についても、やはり論文発表に想定外の手を取られたこともあり当初の予定よりも遅れているが、これも研究上想定内のことであり、やはり論文発表を達成し、いよいよ解析に進む土台を作ったという点からは全体として本来の目標に向かって「おおむね順調に進展している」と評価しうる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)N末端微小管結合領域に関する解析：MTCL1全長タンパク質の精製に本格的に注力し、電子顕微鏡による分子集合状態の解析に進む。HEK293Tを用いた発現系を引き続き検討するとともに、バキュロウイルス発現系を利用した実験も並行して進め、バックアップとする。研究の進展状況に応じて、当初予定した「ヒンジ領域の重要性」を検討する実験も開始する。この中では、架橋された微小管の方向性をライブ観察によって最終的に明らかにするとともに、ゲノム編集法によって作成したMTCL1ノックアウト細胞を利用した機能解析も進める。
(2)C末端微小管結合領域に関する解析：28年度に予定していた「X線線維回折」を連携研究者と開始し、「GTP型チューブリン誘導モデル」を検証する。一方、C末端、N末端微小管結合領域と微小管との結合親和性自身が、GTP型チューブリンに対してより高く、そのことによって結合が正の協同性を持って進むという新たな仮説についても検証する。そのため必要な「TIRF顕微鏡による微小管伸長のライブ観察法の導入」を進め、次の研究課題である「rescue point仮説」の検証実験の基盤づくりも行う。GTP型チューブリン抗体を用いた実験も進める。
(3)AIS微小管束制御メカニズムの解析：MTCL1ノックダウンによってAIS微小管の形成が乱れたマウス個体内プルキンエ細胞に対するEB1/3の局在を検討する実験など、本来、28年度に予定していた実験を完了させる。
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[Journal Article] MTCL1 plays an essential role in maintaining Purkinje neuron axon initial segment.2017
Author(s)
Satake T, Yamashita K, Hayashi K, Miyatake S, Tamura-Nakano M, Doi H, Furuta Y, Shioi G, Miura E, Takeo YH, Yoshida K, Yahikozawa H, Matsumoto N, Yuzaki M, Suzuki A.
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Journal Title
EMBOJ
Volume: 36
Pages: 1227-1242
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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