2016 Fiscal Year Annual Research Report
Experimental and theoretical studies on function of single and multiple molecules
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16H04773
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
樋口 秀男 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (90165093)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
茅 元司 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (00422098)
佐々木 一夫 東北大学, 工学研究科, 教授 (50205837)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | モータータンパク質 / メカニズム / 1分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ダイニンのリンカースイングによってどのくらいの変位があるかを示す実験を行った。まず、ダイニンのリング内にBFP，リンカーN端にGFPを導入した単量体ダイニンを作製し精製を行った。次に，蛍光エネルギー移動効率を測定した結果，高ATP濃度ではFRET効率は高く，ATP濃度低下に伴いFRET効率はじょじょうに低下した．高ATP濃度ではパワーストローク前の状態のダイニンの割合が多いためエネルギー移動効率が高く，ATP濃度低下に伴いヌクレオチド非結合の状態の割合が増加するこため効率が減少したと考えた。この実験と並行してダブルトラップおよびシングルトラップ法を用いて，ダイニンが微小管に結合した後に運動した変位を測定した。その結果、ATP濃度低下に伴い，変位は~8 nm（高ATP濃度）から0 nm（ATPなし）に減少した．
キネシンの力発生にはネックリンカーの開閉のような構造変化が重要な変位を生むと考えれてきた。ネックリンカーの水素結合をしているとされる部位に点変異を導入したキネシンを2種類精製し、1分子力計測を行った。変異体キネシンは天然キネシンに比べてバックステップの頻度がやや増えるものの、著しい変化は見られなかった。次に、ATPアナログAMPPNPを用いてATP結合に伴う2量体キネシンの変位の大きさを3~6pNの負荷で測定した。AMPPNP濃度を10µMと低濃度にすることで、キネシンはAMPPNP状態とヌクレオチドフリー状態を遷移する。その結果、微小管に沿ってプラス端・マイナス端の両方向に5~6nmのステップ状の変位が見られた。この変位の大きさは、キネシンが二足歩行運動するときのステップサイズ(～8nm)よりも小さく、単量体を用いてネックリンカーの構造変化を測定したときの変位(~5nm)と近い値であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ダイニンおよびキネシンの力発生メカニズムの解明に向けて、重要な知見が得られたためおおむね、順調に進んでいると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ダイニンの変位測定が可能となったので、今後データ量を増やしエラーバーを小さくするする努力をおこなう。また、ATP濃度を細かく変化させて、ATP濃度とともにどのように力発生を行うか測定を行う。今年度（29年）に作成した、ネックの動かないダイニンの変位測定を行う。キネシンについては、ATP濃度を変化して、ストローク距離の変化を測定する。
ダイニン・キネシン・ミオシンに共通の理論モデルを構築するために、データを整理し、簡易的なモデル作成し、そのモデルをより実験データーに合致するように調整を行う。
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