2017 Fiscal Year Annual Research Report
細菌べん毛の本数を制御するGTP/ATP結合タンパク質の作動機構
| Project/Area Number |
16H04774
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
小嶋 誠司 名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (70420362)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 細菌べん毛 / FlhF / FlhG |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細菌は運動器官のべん毛を適切な本数および位置に構築することで、効率良い遊泳を可能としている。ビブリオ菌極べん毛の本数はGTPaseであるFlhFが正に、ATPaseであるFlhGが負に制御しており、その活性は細胞の極で発現している。本研究では、FlhFとFlhGのGTP/ATP加水分解サイクルと細胞内局在変化・べん毛本数制御活性の関係を、適切な変異体を用いた生化学・結晶構造解析・１分子蛍光観察により明らかにし、極べん毛が正確に１本だけ形成される仕組みを解明することを目標としている。本年度は、1) FlhFとFlhGのヌクレオチド結合スキームと生化学活性の関係、2) FlhFによる極べん毛形成促進機構、の２点について研究を進めた。1)についてはFlhFの精製法改良に取り組み、コールドショックベクターを用いてFlhFを過剰発現した大腸菌をGDPとMgCl2の存在下で破砕すると、半数程度を可溶性画分に回収できることを見出し、クマシー染色にてほぼ単一バンドになる精製度で十分量の標品を得ることに成功した。この精製標品を用いてGTPase活性の測定を行い、FlhF単独では有意な活性が見られないがFlhGの存在下ではGTP加水分解を検出することができた。また、ゲルろ過クロマトグラフィーによりFlhFはGDP存在下において単量体を、GTP存在下において二量体を形成することが明らかとなった。2)については、GFPを融合させたMSリング構成因子FliFを用いて、ビブリオ菌体内においてFlhFがFliFを極へリクルートすることを見出した。MSリングは基部体において最初に構築されるため、FlhFは細胞極でのMSリング形成を促進することで、極べん毛構築を正に制御していると考えられる。現在FlhFによるFliFの極局在が実際にMSリング形成を反映しているのか、MSリングを単離精製し検討している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では大きく分けて３つの課題（1. FlhFとFlhGのヌクレオチド結合スキームと構造、2. FlhFとFlhGの生化学活性の制御機構、3. 細胞極におけるFlhFの機能発現機構）を掲げている。2017年度はFlhFの精製に成功し順調に進んでいると考えている。1)と2)については、FlhFの精製系が確立したことから、GTPase活性の測定が可能になり、FlhGによるFlhF-GTPaseの活性化を見いだすことができた。精製したFlhFはゲルろ過クロマトグラフィー解析に耐えうる安定性を有し、実際にGDP存在下では単量体を、GTP存在下では二量体を形成することを明らかにすることができた。またFlhGの精製方法を見直すことで、これまで困難であったFlhGのゲルろ過クロマトグラフィー解析も可能になり、FlhGはATP, ADPのどちらの存在下でも単量体であることが示されつつある。さらに、光架橋型GTP, ATPを用いることで、FlhF, FlhGの各変異体がGTPやATPを結合するかどうか検討を始めており、次年度には変異体を用いてヌクレオチド結合スキームと細胞内局在の全貌が明らかになることが期待できる。
3)については、FlhFが極べん毛構築のどの段階で機能するのかを探るため、FlhFが基部体構成因子を極へリクルートするかどうかを検討した。その結果コレラ菌と同様、海洋性ビブリオ菌においてもFlhFがMSリング構成因子のFliFを極へリクルートすることを見出した。今後はFlhFの作用点がFliFの極移行なのか、リング形成なのかを検討していく。また、我々はGFPやVenusを融合したFlhF, FlhGを染色体から発現させる菌株を構築済みで、これらの株を用いて自然な発現量のもとでFlhFとFlhGがどのように細胞内で振舞うのか、その挙動を詳細に観察することを考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
FlhFとFlhGに相同性を示すFtsY, MinDにおいてその生化学活性や立体構造がすでに報告されている。我々も生化学活性の測定が可能になり、ヌクレオチド加水分解活性や結合スキームの解明まであと一歩のところへ近づいてきた。分子レベルでの機能の理解には立体構造の情報が欠かせないため、今後は全長タンパク質の結晶化を目指す。一方で、HubP欠失株の解析から、FlhGはどうやら極からFlhFを解離させるというよりは、極において直接べん毛形成促進能を阻害していることがわかってきた。つまり極においてFlhFとFlhGがどのように作用し、べん毛形成を促進・阻害しているのかを明らかにすることが次の課題となる。そこで昨年度確立した蛍光タンパク質融合株を用いて、FlhFとFlhG、そしてHubPの細胞周期における挙動を注意深く観察し、活性を持つFlhFがどのように極で制御されているのかを、生化学的解析の結果と合わせて明らかにしたい。今年度、FlhFが極へMSリングタンパク質のFliFをリクルートしていることが明らかになったが、構築過程における作用点はわかっていないため検討したい。FlhFは構築済みの極べん毛の基部に検出されるため、基部体の構造に取り込まれている可能性もある。ならばFlhGは極局在するFlhFにどのように作用することで、べん毛形成を阻害するのであろうか？ こうした課題に対し、変異体を用いた生化学性質と形質、および細胞内動態の解析から解明を試みたい。なお、近縁種のV. vulnificusではV. alginolyticusには存在しないFapAがべん毛の形成位置決定に関与することが報告されている。FapAを研究している韓国のグループとも議論しながら、今後はFlhFとFlhGが細胞極でどのような因子と相互作用し、べん毛形成を促進（阻害）しているのかを明らかにしたい。
|
