2018 Fiscal Year Annual Research Report
細菌べん毛の本数を制御するGTP/ATP結合タンパク質の作動機構
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16H04774
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小嶋 誠司 名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (70420362)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細菌べん毛 / FlhF / FlhG |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌は運動器官のべん毛を適切な本数および位置に構築することで、効率良い遊泳を可能としている。ビブリオ菌極べん毛の本数はGTPaseであるFlhFが正に、ATPaseであるFlhGが負に制御しており、その活性は細胞の極で発現している。本研究では、FlhFとFlhGのGTP/ATP加水分解サイクルと細胞内局在変化・べん毛本数制御活性の関係を、適切な変異体を用いた生化学・結晶構造解析・１分子蛍光観察により明らかにし、極べん毛が正確に１本だけ形成される仕組みを解明することを目標としている。本年度は、1) FlhGのヌクレオチド結合スキームと生化学活性の関係、2) FlhG N末端領域のFlhF-GTPase活性およびべん毛本数制御における役割、の２点について主に研究を進めた。1) については、精製したFlhGの凝集しやすい性質を再検討し、ヌクレオチド、特にADPの存在下において凝集が抑えられることを見出した。これをきっかけに、精製直後の標品を用いてFlhGをゲル濾過で解析することに初めて成功し、ATP/ADPの存在下においてFlhGは単量体で存在することを見出した。一方、高いATPase活性を示すFlhG-D171A変異体は、ATP存在下でゲル濾過の溶出位置が高分子側にシフトし、構造が変化していると考えられた。2) については、N末端20残基を欠失させたFlhG変異体の性質を解析した。この変異体はFlhF-GTPaseを活性化できなかった。さらにべん毛形成の抑制能も低下していたが、それはビブリオ菌内での発現量が低下したためであり、過剰発現すると抑制能を示すことがわかった。従ってFlhGのN末端はべん毛形成を抑制する活性には直接関係しないと考えられる。また、N末端欠損により発現量が低下する原因として、FlhGの持つ二箇所の発現開始部位の一つが失われた可能性が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では大きく分けて３つの課題（1. FlhFとFlhGのヌクレオチド結合スキームと構造、2. FlhFとFlhGの生化学活性の制御機構、3. 細胞極におけるFlhFの機能発現機構）を掲げている。2018年度はFlhGのゲル濾過解析に初めて成功し順調に進んでいると考えている。1)と2)については、2017年度に確立したFlhFの精製系と合わせて、FlhGによるFlhF-GTPaseの活性化の機構にFlhGのN末端領域が重要であることを見いだすことができた。また今年度はFlhGのゲルろ過解析に成功し、FlhGはATP, ADPのどちらの存在下でも単量体であることが分かってきた。しかし光架橋型ATPを用いてATP結合能の検討を進めたが、明確な結果を得るには至らなかった。これまでATPの結合部位と推定してきた２つのアミノ酸残基の性質に違いが見られることから、MinDとは異なるFlhGの性質が、べん毛形成抑制能にどう関与するのか明らかにすることが次年度の課題である。
3)については、昨年度に見出したFlhFがMSリング構成因子のFliFを極へリクルートする活性について、大腸菌を用いて検討を進めた。その結果、FlhFの発現によりビブリオ菌FliFのリング形成が促進することを見出し、FliFリングは、FlhFに加えて回転子タンパク質FliGを発現すると形成効率がさらに高まることが明らかとなった。しかしFlhFによる極への移行は、大腸菌ではビブリオ菌ほど顕著ではなかったことから、ビブリオ菌内では、FlhFとともに別の因子がFliFを極へ移行させている可能性が考えられる。また、我々はGFPやVenusを融合したFlhF, FlhGを染色体から発現させる菌株を用いて、自然な発現量のもとでFlhFとFlhGがどのように細胞内で振舞うのか、その挙動の観察を始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
FlhF, FlhGともにN末端領域が活性制御に関係すると考えられているが、この領域を含めた全長の結晶構造はまだ明らかになっていないため、最終年度は全長タンパク質の結晶化を目指す。また、FlhGは極でプラットフォームとして働く膜タンパク質HubPと作用し、FlhF機能を阻害している可能性が示唆されている。そこで、HubPとFlhGの相互作用を、様々なHubPの断片を用いて解析を進め、極においてHubPがFlhGの活性を制御する可能性を検討する。一方、FlhGのN末端領域を欠失した変異体は、ビブリオ菌内での発現量が大きく低下していた。その結果、べん毛遺伝子群のマスターレギュレータと考えられているFlaKの活性を負に制御できず、べん毛遺伝子群が過剰に発現し、多べん毛の形質を示したと考えられる。そこで最終年度には、FlhGの極におけるFlhFの活性制御だけでなく、FlaKへの負の作用によるべん毛遺伝子発現の抑制についても解析を進める。FlhFについては、ビブリオ菌の極へMSリングタンパク質FliFをリクルートすることや、大腸菌を用いた解析からMSリング構築を促進することが分かってきたが、FlhF, FliG存在下で形成したMSリングを精製するとFlhFは含まれていないため、構築過程における作用点は明らかではない。そこでごく短時間の相互作用を捉えることが可能な光架橋法を用いて、FliF-FlhF間相互作用を検討する。最後に、蛍光タンパク質を融合させたFlhF, FlhGを染色体から発現させ、細胞内動態を１細胞周期を通して観察し、作用部位の時空間解析を試みたい。なお、近縁種のV. vulnificusではFapAがべん毛の形成位置決定に関与することが報告されている。FapAを研究している韓国のグループを日本に招き、議論を深める予定である。
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