2017 Fiscal Year Annual Research Report
超高速・超解像１蛍光分子局在顕微鏡法による、接着斑の動的群島機構の解明
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16H04775
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤原 敬宏 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 接着斑 / アクチン骨格 / 拡散運動 / 1分子計測 / 超解像 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、「接着斑は、構成分子がダイナミックに拡散で出入りしている島を単位とし、それが多数集まることによって形成されている」という、「接着斑動的群島仮説」の正否の検証を目的とする。[1] 群島の生細胞超解像－構成分子の高速１蛍光分子同時観察、[2] 接着斑内のアクチン骨格構造の３次元超解像観察、[3] 群島構造の超解像定量、[4] 群島ダイナミクスの超解像マッピング、[5] 硬さの異なる基質に対する群島ダイナミクスの応答検出、の５段階の研究計画のうち、本年度は [2]、[3]、[4] を推進し、以下の進捗があった。
(1) 低酸素条件と生細胞に優しい化学物質の添加を組み合わせて、光退色を大幅に抑制する方法を開発し、1蛍光分子追跡時間を従来の最高40倍（10秒を400秒）に改善した。それにより、接着分子インテグリンの接着斑内での一時停留時間は、秒以下－数秒－数10秒と大きなばらつきがあること、接着斑内の場所により停留時間が異なること、が明らかになった（Tsunoyama et al., Nat. Chem. Biol. 2018；平成30年4月3日にオンライン公開のため、平成29年度の論文リストには含めず）。
(2) 接着斑近傍のアクチン骨格構造（ストレスファイバー終端、膜骨格の網目構造）のライブセル3次元超解像観察をおこなった。10秒間（250 Hzで2500枚）の1分子像の撮像により、Z方向に1ミクロン(100 nm間隔ｘ10枚) の3次元超解像画像を再構成し、これを6回繰り返すことによって、1分間にわたる構造変化を追跡できた。
(3) 接着斑構成分子（パキシリン、ビンキュリン）をノックアウトしたMEF細胞に、超解像蛍光タンパク質プローブを融合したそれぞれの分子を発現させた。内在性と同程度の発現量を示す安定発現株を取得し、超解像観察による群島ダイナミクス検証の準備を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
28年度に、拡散で接着斑に出入りする接着分子インテグリンの、接着斑内での一時停留は、マーカー分子パキシリンの超解像観察で可視化した群島上で有意に起こることを示した。29年度は、この成果をもとに、最近開発した蛍光分子の光退色を大幅に抑制する技術を応用し、一時停留の時間／空間分布のさらに詳細な解析を進めた。また、28年度に完成した3次元超解像－１蛍光分子同時観察顕微鏡システムを活用し、インテグリン拡散運動の1分子追跡や、アクチン骨格構造のライブセル3次元超解像観察をおこなった。さらに、株式会社 arivis (ドイツ) と共同で、超解像構造（アクチン骨格、群島）と1分子追跡データを重ね合わせるソフトウェアの改善を進めて、30年度におこなう予定の3次元同時観察のデータ解析に備えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 接着斑内の3次元アクチン骨格構造と群島構造の超解像同時観察
29年度におこなった「アクチン骨格構造のライブセル3次元超解像観察」と「群島構造の超解像観察」を組み合わせて、パキシリン、ビンキュリンをマーカーとした群島構造の形成／移動／分解と、アクチン骨格構造（ストレスファイバー端、群島間の隙間の網目構造）の変化が空間的、時間的にどのような関係にあるのかを調べる。
(2) 群島構造の超解像定量と構成分子局在ダイナミクスの超解像マッピング
パキシリン、ビンキュリンなどの構成分子によって可視化した超解像群島構造のサイズや寿命の空間分布と、29年度の１蛍光分子運動追跡技術の改善によって明らかになった、大きなばらつき（秒以下、数秒、数10秒）を示すインテグリンの一時停留時間の接着斑内での空間分布が、どのようにカップルしているかを調べる。
(3) 硬さの異なる基質に対する群島ダイナミクスの応答検出
硬さの異なる基質上の培養で、(1) の3次元アクチン骨格構造 (ストレスファイバー端、アクチン膜骨格の網目構造) がどのように応答するか、また、(2) の群島ダイナミクスのマッピング結果がどのように変化するかを検証し、メカノセンシングにおいて動的群島構造が果たす役割を調べる。
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