2016 Fiscal Year Annual Research Report
非チャネル型タンパク質膜挿入マシーナリーの分子機構の解明
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16H04788
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
千葉 志信 京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (20523517)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | YidC / タンパク質膜組込 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
枯草菌にはタンパク質膜組込装置YidCのホモログが２つ（SpoIIIJとYidC2）ある。恒常的に発現しているSpoIIIJの機能低下はYidC2の発現誘導をもたらす。この性質を利用したYidC2-lacZ融合レポーター株は、SpoIIIJの機能低下に呼応してb-galactosidase活性を上昇させる。そのため、この株のSpoIIIJに変異を導入し、yidC2-lacZの発現量を測定することで、簡便に、SpoIIIJ（YidC）の変異体の解析が可能となる。
我々は、この株を利用し、YidC阻害化合物のスクリーニングを行ったところ、現在までにyidC2-lacZの発現を上昇させる化合物を得ることに成功した。今後、これらの化合物がYidC活性を直接阻害しているかどうかについて検討を行う必要がある。
YidCの細胞質領域には２本のヘリックスからなる特徴的な構造がある。この構造の欠失はYidC機能を損なわせることから、この領域が重要であることが示唆されていた。我々は、この領域のシステマティックな変異解析を行い、この領域の塩基性残基がタンパク質膜組込において重要な役割を果たしている可能性を見出した。
YidCは５本の膜貫通領域で膜内に親水性の溝構造を形成している。我々は、この溝に導入された変異によってYidC機能を一部損なっている可能性のあるものを、新たに幾つか見出した。溝の性質が蛋白質の膜挿入という機能を達成する上でどのようなかたちで最適化されているかについて、理解を深めるための手がかりになるかも知れないと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
YidCの機能を阻害するような化合物のスクリーニングについては、現在の所幾つかの候補化合物を得ることができた。これらの候補化合物のさらなる解析にはYidCの膜組込活性をより直接的に観察する系が必要である。そのために、プロテアーゼプロテクションアッセイなどの確立を行っている。その条件検討に時間がかかることは事前に予想されていたが、解決可能な問題と不可能な問題の整理は順調に進んでいる。
YidCの細胞質領域の役割を解明する目的で、網羅的な変異解析を行った。その過程で、この領域の塩基性残基の重要性が網羅的な解析から明らかになりつつある。今後、さらなる詳細な情報を得ることで、この領域の働きが理解できるかも知れないと期待している。
YidCの膜内にある親水性の溝については、その機能を部分的に損なう新たな種類の変異が見出された。これまでに得られた機能欠損変異体からは見出されていなかった生育に関わる表現型も見出されており、非常に興味深い。新たな表現型を示す変異体が見出されたことから、これらの変異体の解析を進めることで、この溝の性質の重要性に関する新たな知見が見出される可能性も期待される。
以上の進捗状況を総合的に判断すると、プロジェクトは現在までのところおおむね順調に進展しているものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
YidCによるタンパク質膜組込を直接的に観察する方法を確立することで、YidC阻害剤候補の化合物のより詳細な評価を行うことが必要であると考えており、その系の確立のための条件検討を引き続き進める予定である。プロテアーゼプロテクションアッセイや、蛍光顕微鏡を用いた方法など、幾つかのアイディアについて、これまで進めてきたものも含めて今後とも条件検討を行い、確立を目指す。
また、YidCの細胞質領域の塩基性残基の重要性については、さらなる網羅的な変異解析を行うとともに、基質側の変異の影響も含めて検討することで、その役割を明らかにすることを目指す。既に解明された立体構造構造情報を利用できるような系を使うことで、構造と機能の関連を明確化する。
YidCの溝に変異が導入されたことで新たな表現型を示した変異体については、同様の性質を与えると思われる変異を溝に導入した他の変異体も作製し、その表現型を観察することで、この溝の性質と機能の関わりを明らかにする。また、それらの変異に対する基質側の変異の効果も合わせて検討し、新たに観察された表現型がどのような意味を持つのかについて解析する。
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