2017 Fiscal Year Annual Research Report

非チャネル型タンパク質膜挿入マシーナリーの分子機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16H04788
Research Institution	Kyoto Sangyo University
Principal Investigator	千葉志信京都産業大学, 総合生命科学部, 准教授 (20523517)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	YidC / タンパク質膜組込
Outline of Annual Research Achievements	枯草菌は、タンパク質膜組込装置YidCのホモログを二つ持つ（SpoIIIJ、YidC2）。第一のホモログSpoIIIJの活性低下に呼応して、第二のホモログYidC2の発現が上昇する。そのため、YidC2をコードする遺伝子のほとんどをLacZに置き換えたyidC2'-lacZレポーターを持つ株は、細胞のYidC活性の低下に呼応してb-ガラクトシダーゼ活性を上昇させる。本研究では、このレポーターを利用し、YidCの機能解析や、YidCを阻害する化合物のスクリーニングを進めてきた。前年度までに、YidCを阻害する化合物のスクリーニングを行い、レポーター株のb-ガラクトシダーゼ活性を上昇させる化合物を複数得た。本年度は、この化合物のYidC活性阻害効果を確認するため、YidC基質であるMifMの膜組込をより直接的にアッセイする方法の確立を試みてきたが、まだその確立には至っていない。MifM以外の基質で膜組込アッセイを確立することも試みるべく、上記のlacZレポーターを改変する方法で新規YidC基質の探索を行ってきた。その結果、これまでに二つの膜タンパク質がYidC依存的に膜挿入されることが示唆された。興味深いことに、以前MifMの変異解析から得られたYidC基質の条件が、これらの膜タンパク質では見られず、MifMとは異なるかたちでYidCと相互作用をしている可能性が浮上した。この新たな基質も、YidC研究のモデル基質として有用であるかもしれない。前年度までに、YidCの細胞質領域の変異解析を行い、この領域の塩基性アミノ酸残基の重要性を示唆する結果を得た。本年度は、さらなる変異解析を行い、細胞質領域の特定の場所にそのような残基が位置している必要はないことが示されつつある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason YidCを阻害する化合物の探索については、一次スクリーニングで得られた候補化合物の効果を確認する系の確立を目指している。しかしながら、現時点ではまだ有効なアッセイ系の確立には至っていない。一方、その過程において、YidCの新機基質と思われる膜タンパク質を二つ同定した。そのアミノ酸配列から、MifMとは異なる様式でYidCと相互作用する可能性が考えられ、YidCのメカニズム研究やYidC阻害剤のスクリーニングにおいて、新たなモデル基質として利用できる可能性が期待される。 YidCの細胞質領域の解析については順調に進展しており、MifMの膜挿入において、YidCの細胞質領域のどのような性質が重要であるのかについて、おおよその理解が進んだ。また、前述したように、新たなYidC基質が見出されたため、これらの基質がYidCの細胞質領域のどのような性質を要求するのかについて検討することが可能となり、そのような解析を今後行うことにより、YidCの細胞質領域の重要性ややくわりについてより包括的な理解が進む事が期待される。これらの状況を総合的に判断し、「おおむね順調に進展している」とした。
Strategy for Future Research Activity	YidCの活性を阻害する化合物の探索について、今後、引き続きプロジェクトを遂行する。候補化合物の評価を行うためのアッセイ系の確立を目指す。特に、MifMのみならず、昨年度、新たに同定された新規YidC基質を用いたアッセイ系の確立も試みる。これらの系が確立できたならば、YidC阻害剤の候補化合物について、その活性を評価する。また、それらの結果を受け、必要であれば、さらに別の化合物ライブラリを対象に、一次スクリーニングを継続する。 YidCの細胞質領域の重要性についても、今後引き続き変異解析を継続し、より詳細の情報を得る。また、前述したように、昨年度、YidCの新規基質が同定されたため、これらについても、この領域のどのような性質に依存して膜挿入されているのかについても検討を行う。その結果と、これまで得られた結果を総合評価し、YidCの細胞質領域の役割について考察を深める。