2017 Fiscal Year Annual Research Report
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16H04806
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
田中 博和 大阪大学, 理学研究科, 助教 (10589922)
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2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞、組織 / 植物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の地上部の器官の表皮はクチクラに覆われている。クチクラは表皮細胞と外部環境の境界面に形成される傾向が強いが、その形成の空間的制御機構はよくわかっていない。本研究課題では空間的制御についての知見を得るために、クチクラ形成に関わるABCG11などの膜タンパク質の細胞膜局在の制御系の研究を行っている。本年度は新規制御因子を同定するための一過的実験系の検討を行った。まず、ベンサミアナタバコの葉の表皮細胞を用いた一過的発現実験を行うためのプラスミドベクターを構築した。RPS5a、CaMV 35S、ALE2 の３種類のプロモーターの下流に蛍光タンパク質のコード領域をつなげたコンストラクトを作成し、アグロバクテリアの接種により、ベンサミアナタバコに発現させ、蛍光観察を行ったところ、CaMV 35S プロモーターを用いたコンストラクトを用いた場合に最も強い発現が確認できた。この系を用いて低分子Gタンパク質ARF1とRFPの融合タンパク質を発現させたところ、葉の表皮細胞の内部で斑点状のRFPシグナルが確認できたことから、今回構築したベクターにより、葉の表皮細胞で目的のタンパク質を程よい強さで発現させることができると期待される。また、ABCG11のコード領域の一部を欠失した３種類の変異型ABCG11をYFPとの融合タンパク質としてベンサミアナタバコに発現させたところ、野生型ABCG11を用いた場合は細胞の周縁部に細胞膜由来と思われるシグナルが見られたが、２種類の変異型ABCG11では細胞内部のシグナルが強く観察された。これらの結果から、欠失した領域はABCG11の細胞膜局在に必要な領域を含んでいると期待される。また、膜交通因子の変異体の整備の一環として、ARF GEF BIG2 の機能ドメインをコードする領域に変異を持つシロイヌナズナ変異体をcrispr-Cas9系を用いて作出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RFP融合タンパク質を一過的に葉の表皮細胞で発現させるためのプラスミドベクターに用いるプロモーターの評価を行い、プロモーターの特性を評価した。最適と思われたベクターを用いて今後、変異型の制御系タンパク質とGFP-ABCG11を共発現させることで、ABCG11の局在制御に関わる因子を効率よく同定できると期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回作成したプラスミドベクターを用いた一過的発現系を用いて、ABCG11の局在制御に関わる制御因子を探索する。候補因子についてはシロイヌナズナの変異体におけるGFP-ABCG11の局在を詳細に解析し、候補因子の重要性や冗長性を明らかにする。クチクラ形成と表皮の細胞形態の制御に関わるALE2やACR4などの受容体型プロテインキナーゼとの相互関係も解析し、クチクラ形成の空間的制御のメカニズムの解明を目指して研究を進める。
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