2017 Fiscal Year Annual Research Report
長期記憶形成における時計遺伝子periodの新規機能の解明
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16H04816
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
坂井 貴臣 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (50322730)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上野 耕平 公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 副参事研究員 (40332556)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Period / 長期記憶 / ショウジョウバエ / 時計遺伝子 / LNd |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではショウジョウバエの時計遺伝子period(per)に注目し，長期記憶形成に必須なper発現細胞の同定と，perの分子機能を解明することを目的として研究を行った。人為的に神経活動を抑制する技術を利用してper発現細胞の中で長期記憶に必須な神経細胞群を調べて結果，LNd, l-LNv, LNd, DN1 と呼ばれる4つの神経細胞群の関与が明らかになった。さらに，これらの細胞群のperの発現を抑制してところ，LNdと DN1で発現するperが長期記憶形成に関与することが明らかになった。
Perタンパク質は複数のタンパク質との相互作用ドメインを持つ。長期記憶形成におけるPerタンパク質の分子機能を推定するため，Perタンパク質のどのドメインが長期記憶形成に必須であるのかを明らかにする実験を計画した。Perのタンパク質相互作用ドメインであるPASドメインを欠失させたPerΔPAS，PerのPASドメインを含むPer truncated form（Per-PAS），転写因子Clock/Cycleとのinteraction domainを含むPer-CCID，光受容タンパク質Cryとのinteraction domainを含むPer-C，という４つの改変型Perを強制発現するための形質転換系統を作製した。さらに，少なくともLNdにおいてはPerΔPAS強制発現により長期記憶形成においてドミナントネガティブ効果が得られることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究から，per発現細胞の中でもLNdと呼ばれる神経細胞群が長期記憶形成に関与することが示唆されていた。しかし，最近の研究結果から，DN1と呼ばれる神経細胞群もPer依存的な長期記憶に必須であることが明らかになった。平成29年度はLNdに注目し，LNdのみに改変型Perを発現させて長期記憶を測定するため， mCherry-off GFP-onシステムと名付けた遺伝子発現システムの確立に取り組んだ。このシステムでは，組換え酵素FLPによるフリップアウト法と，２つの遺伝子発現システム（GAL4/UAS, LexA/LexAop）を組み合わせ，目的遺伝子が発現しない場合はLNdが赤色蛍光を発し，発現した場合は赤から緑の蛍光に変化する。これまでに，GAL4とLexAの共発現がLNdのみで確認される系統のスクリーニングを終了し，いくつかの組み合わせを見出した。現在はLNdにPerΔPASを強制発現するための形質転換系統を作製している。
作製した４つの改変型Perを時計ニューロンで強制発現した時にサーカディアンリズムに及ぼす影響を確認した。その結果，PerΔPAS，Per-PAS，Per-CCIDの強制発現によりリズム以上が確認された。よって，これら３つの改変型Perはドミナントネガティブ効果が期待される。今後は長期記憶の実験に用いる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度には，mCherry-off GFP-onシステムに利用する形質転換系統の作製が一部完了し，FLPにより赤色蛍光から緑色蛍光へと変化することも確認できた。また，平成29年度には，LNd特異的な遺伝子発現を可能にするGAL4とLexAの組み合わせを複数見出した。これまでに全身でperを過剰発現すると長期記憶が促進することが分かっているので，今後はLNd特異的にperを過剰発現した時に長期記憶促進が生じるかどうかを明らかにする。また，LNd特異的にPerΔPASもしくはPer-PASを発現させ，長期記憶が形成されなくなるかどうかも明らかにする。さらに，LNdの神経活動を抑制したときに長期記憶が形成されるかどうかも確認する。
PerΔPASにはCCIDが含まれているため，PerΔPASの強制発現は内在性のPerの発現を抑制する可能性が考えられる。Per-CCIDの強制発現がPerΔPASの強制発現と同様の表現型を示すかどうかを確認し，Per-CCIDをLNdに強制発現した時の内在性のPerの発現が抑制されるかどうかを免疫染色により明らかにする。
LNdにおけるPerの機能と，DN1におけるPerの機能が異なる可能性も考えられる。今後は，DN1特異的に改変型Perを発現させた時に長期記憶に及ぼす影響も検証していく。
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Research Products
(7 results)
