2016 Fiscal Year Annual Research Report
Genetic and neural basis of social behaviors in vertebrates
| Project/Area Number |
16H04819
|
|---|
| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
|---|
Principal Investigator |
成瀬 清 基礎生物学研究所, IBBPセンター, 特任教授 (50208089)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 神経科学 / 社会行動 / メダカ / DD_cre / ノックイン / c-fos / ゲノム編集 / オプシン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
樹立したTG(c-fos:DD_cre)系統をユビキタスなGaudi及びGFPレポーター系統と交配し、TMP存在下でPTZ処理し、脳内でc-fos依存性のCre発現による組換えに由来する蛍光を観察したが明確なシグナルを検出することができなかった。そこでc-fos:DD_creプラスミドをリポーター系統に直接導入して組換え活性を検討したところfosmidクローンを用いた遺伝子導入では脳内のc-fosのプロモーター活性を十分に再現できないことが示唆された。そこで我々が独自に開発したknock-in用のドナーベクターhsP:GFPをc-fos遺伝子座5‘領域に導入しPTZ処理をしたところ、PTZ依存性のGFP蛍光を脳内で検出することに成功した。次にHsP:DD_GFPドナーベクターを作成し、TMP存在下でPTZによるc-fosの誘導を行ったところ、脳内でのGFP発現を検出することができた。同時にHsP:DD_CreをユビキタスなGFPリポーター系統に導入したところTMP処理なしでもかなり多くの組織で組換えが誘導された。一方で神経系に特異的はリポーター系統Tg (HuC:loxP-DsRed-loxP-GFP)に導入した場合には、TMP存在下でのPTZ処理によりかなり特異的な組換えが神経系で観察されることも明らかとなった。これらのデータから神経興奮に由来するc-fos発現をGFPなどの蛍光タンパク質で再現するためにはknock-inによるde novoプロモーターの利用が必須で、DD_Creによる組換えによって神経系をラベルするためには適切な神経特異的リポーター系統を選択する必要があることが明らかとなった。
ゲノム編集によるオプシン遺伝子ノックアウト作成ではsws1遺伝子に変異を導入したG0個体を作成し、LWS2遺伝子に変異をもつ系統と交配しF1を作成した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
フォスミドクローンによる遺伝子導入では脳内でのc-fosプロモーターの活性を十分に再現できないことが判明するなど系統の樹立に予想以上の時間がかかっている。Knock-inによるde novoプロモーターの利用によってc-fos発現そのものはGFPにより再現できることが分かったが、次にknock-inによりDD_creを発現させた場合には不安定化ドメインによるcreタンパク質の分解が初期胚からcre活性を抑えるために十分ではないことが判明した。この場合TMPを作用させない場合にも多くの細胞で組換えが起こるなど、成体での神経系の蛍光ラベルにはユビキタスなGFPレポーター系統との組み合わせでは難しいことが明らかになってきた。一方でHuCプロモーターを用いたリポーター系統との組み合わせでは神経系特異的な組換えがTMP依存的におこることも示唆されている。Creドライバー系統と目的とする組織特異的なリポーター系統の適切な組み合わせを探す必要があるなど、成魚での神経活動依存性の神経系可視化では実験条件の微妙な調整が不可欠であることが明らかとなってきた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Creドライバー系統の作成ではknock-inによるDD_creドライバー系統作成を用いる。またレポーター系統ではユビキタスなプロモーターではなく神経組織特異的なリポーター系統を用いて研究をすすめる。当初計画ではcre組換えタンパク質を用いて活動している神経系をラベルすることを計画していたが、DD_GFPをc-fos遺伝子座にknock-inした系統を用いることで、TMP存在下でPTZ処理することでGFP蛍光を神経系で観察できたことから、TMP存在下で配偶行動をおこし、配偶行動依存性にGFPを発現させ、固定後に直接脳組織を観察することで神経系を可視化する実験系を新たに導入する。
|
Research Products
(1 results)
