2018 Fiscal Year Annual Research Report
深海底熱水活動域が育む微生物共生系：第三の分子生物学で紐解く生物間相互作用
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16H04843
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中川 聡 京都大学, 農学研究科, 准教授 (70435832)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / 共生 / 深海底熱水活動域 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、深海底熱水活動域において共生関係にある化学合成微生物―大型生物間の相互作用を、世界で初めて第三の分子生物学（=グライコミクス）の観点から解明することにある。具体的には、微生物の『糖鎖と修飾タンパク質の組み合わせが、特定生物間の共生を成立させる分子基盤である』という独自の仮説を検証するため、申請者が深海微生物に見いだしてきた(1)特異糖鎖の生合成経路（糖鎖関連遺伝子の発現様式・破壊実験・酵素化学的性状）、(2)糖鎖修飾タンパク質の機能・修飾様式（糖タンパク質のプロテオーム）を、細胞外共生系および細胞内共生系のそれぞれにおいて解析する。本研究は深海底における異種生物間の分子的コミュニケーション手段の研究を通じて、人類に蔓延する病原性微生物の誕生過程の解明、さらには共生（感染）メカニズムを標的とした革新的治療法の開発に益することを目指している。
平成30年度は、深海底熱水活動域に固有の化学合成微生物群が有する糖鎖関連遺伝子群の機能解析を進めた。具体的には、これまで申請者らが実施した調査航海において、インド洋中央海嶺等から採取した巻貝を主要な解析対象とし(特にアルビンガイと呼ばれる巻貝。本共生系では、既に主要共生微生物系統群に近縁な微生物の分離培養・性状決定・ゲノム解析に成功しているためである)、共生微生物と分離培養株を比較しながら、主に(a)メタゲノム解析による糖鎖関連遺伝子群の同定、(b)糖鎖関連酵素の発現・精製、(c)糖鎖関連酵素の性状解析を実施した。(b)において、大腸菌の形質転換および発現誘導・精製が想定より困難であったが、これまでに当面の性状解析に足る量の糖鎖関連酵素群を取得することに成功している。なお、以上に関連する成果の一部は複数の学会や国際誌等で報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生態学的に重要かつ産業的応用へのポテンシャルも高い新規糖鎖関連酵素群を取得することに成功し、性状を解析している。これらは今後種々の解析において基盤的役割を果たすとともに、当初想定していなかった新しい研究展開を可能とするものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、前年度解析した細胞内共生系（インド洋の熱水活動域等から採取したアルビンガイと呼ばれる巻貝を対象とする。本共生系では、既にイプシロンプロテオバクテリアと呼ばれる主要共生微生物系統群に近縁な微生物の分離培養・性状決定・全ゲノム解析に成功しているためである）を主要な解析対象とする。本細胞内共生系を対象として、以下1および2を実施し、糖鎖修飾タンパク質の機能解明を目指す。
1. 糖鎖修飾タンパク質の機能・局在性の同定
化学合成共生微生物において糖鎖修飾をうけているタンパク質の機能を網羅的に同定するため、試料から分画・調整した細胞内共生微生物および近縁の培養株からタンパク質を調整する。調整したタンパク質をそのまま用いるグライコプロテオーム解析が困難な場合は、必要に応じて2次元電気泳動で個々のタンパク質を分離する。シッフ反応により全糖鎖を染色し、各スポットをペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）法に供する（機能・局在性の同定に必要なゲノム情報はこれまでの研究で取得することに成功している）。近縁病原菌であるCampylobacterでは同様の手法により、多数の糖タンパク質が既に同定されているため、本解析で得られる結果と比較することが可能である。
2. タンパク質の糖鎖修飾部位の同定
2-a. 糖鎖修飾部位の決定: 1.で調整した糖鎖修飾タンパク質における糖鎖修飾部位（どのアミノ酸に結合しているか、また特定のアミノ酸配列があるか）を、必要に応じて安定同位体による標識技術（IGOT法）により決定する。
2-b. 個別タンパク質の糖鎖の構造解析: 2-a.において各タンパク質から切り出した糖鎖を精製・ラベル化し、CE-MS等の質量分析器を用いて構造解析する。なお糖鎖の切り出しにはヒドラジン分解法を用い、プロナーゼ分解法等も併用する。
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