2019 Fiscal Year Annual Research Report
"A Sweet and Calorie-free Bacillus!?": Production of L-glucose in B. subtilis
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16H04895
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
中村 顕 筑波大学, 生命環境系, 教授 (10207863)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 健一 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20230732)
矢嶋 俊介 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (90301548)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | L-glucose / L-gluconate / 枯草菌 / イノシトール / 醗酵生産 / 結晶構造解析 / 部位特異的変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1, L-gluconate醗酵生産系の確立
前年度の解析から、枯草菌内での該当遺伝子の発現にはPrpsOと枯草菌コドン使用頻度に最適化した遺伝子(Bsと表記)の組み合わせが適していることが判明したので、まず枯草菌ゲノム上amyE locusに導入したPrpsO-iolGの下流にオペロンを形成するようにiolM(Bs)を導入したが、同遺伝子の発現は確認できなかった。そこでpHT255のPgrac100の下流にiolM(Bs), iolN(Bs), lgnH(Bs)をオペロン状に導入したプラスミドを作製し、上記枯草菌株に導入した。この株をmyo-inositolを添加して培養し、LC-MSで培養上清を分析したが、変換産物は検出されなかった。同株の細胞抽出液を用いて検討したところ、IolG反応産物のinosose、IolM(Bs)反応産物のdiketo-inositolの検出に成功したが、IolN(Bs)以降の反応産物である5-keto-L-gluconate、L-gluconateは検出されなかった。iolN, lgnHの発現量に問題があると考えられる。導入遺伝子の発現確認及び培養条件の検討を今後行っていきたい。
2, 枯草菌宿主の改良
1,の検討が想定以上に遅れたため、枯草菌宿主のさらなる改良には至らなかった。
3, 酵素改変によるL-gluconate reductaseの創製
前年度に取得したLgdAの基質結合部位の変異体R178Aについて詳細な解析を行い、同変異体がscyllo-及びmyo-inositolに対する活性を消失しているがL-glucoseに対する活性は保持していることを明らかにした。同変異体の結晶構造解析から、R178A変異により活性中心を構成するD191の側鎖の向きが変わっていることが判明した。
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| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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