2016 Fiscal Year Annual Research Report
Characterization of the microbial functions in global phosphorus cycling
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16H04899
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
廣田 隆一 広島大学, 先端物質科学研究科, 助教 (90452614)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ホスホン酸 / 酸化還元 / Actinobacteria / ホスホエノールピルビン酸ムターゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
無機の還元型リン化合物の生成経路は不明であるが、ある種のホスホン酸は放線菌から生成することが知られており、その生合成経路も一部明らかにされている。そこで、ホスホン酸を介した間接的な亜リン酸、次亜リン酸生成の可能性を検証するため、ホスホン酸を生成するバクテリアのスクリーニングを行った。放線菌や一部のバクテリアに高エネルギーリン酸化合物であるホスホエノールピルビン酸（PEP）を介して+III価のリンから構成されるホスホン酸を生成する経路が発見されている。PEP mutase(PepM)はP(+V)からP(+III)の直接的な還元を担う鍵酵素である。広島大学微生物資源コレクション（HUT）保有の放線菌ゲノムからゲノムDNAを抽出し、PepMの保存領域を対象とした縮重プローブを用いてPCRを行い、pepM保有菌株の探索を行った。その結果、83株のうち少なくとも8株が陽性であり、ホスホン酸生産菌である可能性が示唆された。現在これらの株のホスホン酸性性能を調べている。一方、還元型リン化合物の酸化経路については、環境中から得られた土壌細菌、水圏微生物を対象として、亜リン酸および次亜リン酸資化能を調べた。その結果、直接亜リン酸/次亜リン酸を資化して有意な増殖を示す株は得られなかった。そこで、集積培養系を用いた単離を試みたところ、数株の亜リン酸資化能を有するグラム陰性のバクテリアが得られた。このうち、亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtxD)活性の有無から、PtxDあるいはC-Pリアーゼによって亜リン酸の資化を行うと考えられるものとに分類された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度のスクリーニングにより、ホスホン酸合成能を有すると考えられるPepM陽性細菌を得ることができた。本研究ではライブラリから約10％の頻度でPepM陽性菌体が発見され、イリノイ大学の研究グループによる報告（約5%）よりもやや高い割合であったが、母数の違いもあるため、分布の割合としては同程度と考えられる。また、還元型リン化合物の酸化経路についても、亜リン酸/次亜リン酸酸化細菌をスクリーニングすることに成功しており、酸化様式による分類も既に進めている。次年度は予定通り、直接リン酸の還元を行う細菌のスクリーニング、および今年度発見された細菌によるリンの酸化還元に関する分子レベルでの解析を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
リン酸からの直接的還元を行う微生物については、ゲノム解析、遺伝子破壊による分子生物学的なアプローチに加え、既に研究責任者らが開発している亜リン酸、次亜リン酸測定系を活用した生化学的解析により関連遺伝子の同定と解析を行う。遺伝子の機能解析は、大腸菌による組換えタンパク質を用いた生化学的解析によって、タンパク質の機能解析を1H-NMR, 31P-NMRにより行う。ホスホン酸合成に関与する遺伝子は一般的にクラスターを形成しており、コスミド等を利用する事で、異種発現による解析が可能である。すでにバクテリアの二次代謝生産遺伝子クラスターの発現に適したシステムを導入済みであり、抗生物質ホスホノスリキシン生合成遺伝子クラスター（23kb）の異種発現にも成功している。異種発現が機能しない場合は、大腸菌を用いた組換えタンパク質を利用する。
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