糖非発酵性細菌のペプチダーゼ類を標的とした新規抗菌剤開発

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H04902
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 田中 信忠 昭和大学, 薬学部, 准教授 (00286866)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 糖非発酵性細菌 / ペプチダーゼ / 立体構造 / 抗菌剤 / ドラッグデザイン

Outline of Annual Research Achievements

糖非発酵性グラム陰性細菌は、ブドウ糖ではなく、蛋白質やペプチドをエネルギー源とする。近年同定されたS46型ペプチダーゼ類は、ヒトに存在しないジペプチジルペプチダーゼであり、細菌のペリプラズムにおいて、他のペプチダーゼ類と協調的に種々のペプチドを分解している。本研究は、新規作用機序の抗菌剤を開発するため、歯周病に関与する慢性歯周炎原因菌Porphyromonas gingivalisや根尖性歯周炎原因菌Porphyromonas endodontalisあるいは多剤耐性菌として悪名高いStenotrophomonas maltophilia等の糖非発酵性細菌が持つS46ペプチダーゼ類に関する生化学的解析や立体構造解析、in silico, in vitro両面での阻害剤探索と酵素／阻害剤複合体の立体構造解析に基づく阻害剤の構造最適化研究を展開するものである。
平成29年度は、28年度にin silicoスクリーニングにより見出したPorphyromonas gingivalis由来dipeptidyl peptidase 11（PgDPP11）に関し有意な阻害能を有する化合物（化合物X）とPgDPP11との複合体の結晶化に取り組んだ。その結果、国際宇宙ステーション日本実験棟「きぼう」を利用した高品質結晶生成実験により、PgDPP11と化合物Xとの複合体の結晶化に成功した。X線結晶構造解析の結果、PgDPP11に対する化合物Xの結合様式を解明することができた。化合物Xは、in silicoスクリーニングで予想した通りPgDPP11の活性部位に結合していた（投稿準備中）。また、Stenotrophomonas maltophilia由来dipeptidyl peptidase 7（SmDPP7）の結晶化に取り組み、結晶化に成功した（未発表）。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上述の様に、PgDPP11に関し、in silicoスクリーニングで得られた化合物XのPgDPP11に対する結合様式を確認することができた。これまで我々は、S46ペプチダーゼファミリーに属するDAP BIIやPgDPP11に関し、いくつかのペプチド類との複合体構造の決定に成功している。しかし、S46ペプチダーゼに対して阻害能を有する非ペプチド性化合物は知られておらず、それらとS46ペプチダーゼ類との複合体構造は得られていなかった。化合物Xは非ペプチド性化合物であることから、ペプチド化合物との複合体の結合情報に加え非ペプチド性化合物の構造情報を得ることは、阻害剤デザインを多面的に展開することに繋がり非常に意義深い。また、PgDPP11とは基質特異性の異なる酵素であるSmDPP7（DPP7：疎水性、DPP11：酸性）に関して結晶化に成功し、構造解析を進めている。従って、非ペプチド性阻害剤候補化合物XのPgDPP11に対する結合様式を解明したこと並びに基質特異性が異なるS46ペプチダーゼであるSmDPP7の結晶化に成功したことは計画2年目の成果として十分であり、進捗状況として「おおむね順調」と評価できる。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度は29年度と同様にPgDPP7, PgDPP11, PeDPP7, PeDPP11, SmDPP7を対象とし、PgDPP11及びSmDPP7の立体構造情報と各々の酵素の大量調製系に基づき、in silico及びin vitroスクリーニングを出発点として、候補化合物の評価、ヒット化合物及び誘導体の合成、Ｘ線結晶構造解析による結合様式確認により次の最適化サイクルへ繋げるという流れで研究を展開し、P1残基特異性の異なる（DPP7：疎水性、DPP11：酸性）各酵素に対する阻害剤開発を目指す。
30年度-1．In silicoスクリーニングによる各酵素の新規阻害剤探索とその評価
（１）29年度までに見出したPgDPP11やSmDPP7に関する第一世代阻害剤と各標的酵素との複合体結晶を調製し、Ｘ線結晶構造解析を行う。（２）（１）で得られた第一世代阻害剤の標的酵素への結合様式に基づき、結合エネルギーなどを考慮して第二世代阻害剤をデザインする。（３）Kurz教授のグループにおいて、第二世代阻害剤を合成する。（４）第二世代阻害剤の標的酵素阻害活性を上記と同様に評価する。（５）第二世代阻害剤と標的酵素との複合体結晶を調製し、シンクロトロン放射光を用いた高分解能結晶構造解析により第二世代阻害剤の結合様式を解明し、構造最適化に繋げる。
30年度-2．PeDPP7, PgDPP7, PeDPP11の立体構造解析および新規阻害剤探索とその評価
（１）PeDPP7, PgDPP7, PeDPP11の結晶化条件最適化、X線結晶構造解析を実施する。（２）約500万化合物から成る市販化合物ライブラリに対し、in silicoスクリーニングを実施する。（３）（２）で見出された候補化合物群の標的酵素阻害活性を評価する。酵素活性阻害を指標とした生化学的評価と結合強度を指標とした物理化学的評価を併用する。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structures of a bacterial dipeptidyl peptidase IV reveal a novel substrate recognition mechanism distinct from that of mammalian orthologues (2018)
  • Author(s): Roppongi Saori、Suzuki Yoshiyuki、Tateoka Chika、Fujimoto Mayu、Morisawa Saori、Iizuka Ippei、Nakamura Akihiro、Honma Nobuyuki、Shida Yosuke、Ogasawara Wataru、Tanaka Nobutada、Sakamoto Yasumitsu、Nonaka Takamasa
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Pages: -
  • DOI: 10.1038/s41598-018-21056-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] RNaseLにおける酵素活性化機構解明を目指した構造生物学的研究 (2017)
  • Author(s): 田中信忠
  • Journal Title: SAR News Volume: 32 Pages: 10-18
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Periplasmic form of dipeptidyl aminopeptidase IV from Pseudoxanthomonas mexicana WO24: purification, kinetic characterization, crystallization and X‐ray crystallographic analysis (2017)
  • Author(s): Saori Roppongi Chika Tateoka Mayu Fujimoto Ippei Iizuka Saori Morisawa Akihiro Nakamura Nobuyuki Honma Yoshiyuki Suzuki Yosuke Shida Wataru Ogasawara Nobutada Tanaka Yasumitsu Sakamoto Takamasa Nonaka
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Volume: 73 Pages: 501-606
  • DOI: 10.1107/S2053230X17014911
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 微生物Dipeptidyl aminopeptidase IVの結晶構造解析 (2018)
  • Author(s): 六本木沙織、鈴木義之、館岡千佳、藤本真友、森澤さおり、飯塚一平、中村彰宏、本間宣行、伊藤康広、志田洋介、小笠原渉、田中信忠、阪本泰光、野中孝昌
  • Organizer: 2017年度量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] Pseudoxanthomonas mexicana WO24由来Dipeptidyl aminopeptidase IVの構造・機能解析 (2018)
  • Author(s): 中村彰宏、本間宣行、六本木沙織、鈴木義之、志田洋介、阪本泰光、飯塚一平、伊中浩治、田仲広明、木平清人、山田貢、吉崎泉、合田浩明、野中孝昌、田中信忠、小笠原渉
  • Organizer: 第12回 日本ゲノム微生物学会年会
• [Presentation] Pseudoxanthomonas mexicana WO24由来Dipeptidyl aminopeptidase IVの基質認識機構の解明 (2018)
  • Author(s): 中村彰宏、本間宣行、六本木沙織、鈴木義之、志田洋介、阪本泰光、飯塚一平、伊中浩治、田仲広明、木平清人、山田貢、吉崎泉、合田浩明、野中孝昌、田中信忠、小笠原渉
  • Organizer: 日本農芸化学会2018年度大会
• [Presentation] 部位特異的変異導入解析によるFamily S46ペプチダーゼの基質認識残基の同定 (2018)
  • Author(s): 本間宣行、中村彰宏、六本木沙織、鈴木義之、志田洋介、阪本泰光、飯塚一平、伊中浩治、田仲広明、木平清人、山田貢、吉崎泉、合田浩明、野中孝昌、田中信忠、小笠原渉
  • Organizer: 日本農芸化学会2018年度大会
• [Presentation] X線結晶構造に基づく多剤耐性菌由来DPP-7阻害剤の設計と評価 -国際宇宙ステーションで抗菌薬を開発する- (2018)
  • Author(s): 関拓海、奥野優香、櫻井有紀、日高興士、宮崎杏奈、北條恵子、六本木沙織、阪本泰光、伊藤康広、鈴木義之、小笠原渉、田中信忠、木平清人、山田貢、吉崎泉、田仲広明、伊中浩治、津田裕子
  • Organizer: 日本薬学会第138年会
• [Presentation] 微生物ジペプチジルアミノペプチダーゼIVの結晶構造解析 (2018)
  • Author(s): 六本木沙織、鈴木義之、館岡千佳、藤本真友、森澤さおり、飯塚一平、中村彰宏、本間宣行、伊藤康広、志田洋介、小笠原渉、田中信忠、阪本泰光、野中孝昌
  • Organizer: 日本薬学会第138年会
• [Presentation] Family S46ペプチダーゼの新規基質認識残基の同定 (2017)
  • Author(s): 中村彰宏、伊藤康広、鈴木義之、六本木沙織、飯塚一平、阪本泰光、田中信忠、小笠原渉
  • Organizer: 第17回日本蛋白質科学会
• [Presentation] Enzymatic characterization of S46 peptidase from pathogenic bacteria (2017)
  • Author(s): Nobuyuki Honma, Yasuhiro Ito, Akihiro Nakamura, Saori Roppongi, Yuki Sakurai, Yoshiyuki Suzuki, Koushi Hidaka, Yuko Tsuda, Yasumitsu Sakamoto, Nobutada Tanaka, Wataru Ogasawara
  • Organizer: 2017 1st STI-Gigaku
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Crystal structures of dipeptidyl aminopeptidase IV from non-fermenting gram negative rods. (2017)
  • Author(s): Roppongi, S., Tateoka, C., Suzuki, Y., Ito, Y., Fujimoto, M., Morisawa, S., Iizuka, I., Ogasawara, W., Tanaka, N., Sakamoto, Y., and Nonaka, T.
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] S46 family bacterial dipeptidyl aminopeptidases as novel antibiotics targets. (2017)
  • Author(s): Sakamoto, Y., Suzuki, Y., Iizuka, I., Tateoka, C., Roppongi, S., Fujimoto, M., Ito, Y., Inaka, K., Tanaka, H., Yamada, M., Ohta, K., Gouda, H., Nonaka, T., Ogasawara, W., and Tanaka, N.
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of substrate recognition residues in family S46 peptidase from pathogenic non-fermenting gram-negative bacteria. (2017)
  • Author(s): Nakamura, A., Ito, Y., Suzuki, Y., Roppongi, S., Hidaka, K., Sakamoto, Y., Tanaka, N., and Ogasawara, W.
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of Substrate Recognition Residues in Family S46 Peptidase from Gram-Negative Bacteria (2017)
  • Author(s): Nakamura, A., Ito, Y., Suzuki, Y., Roppongi, S., Hidaka, K., Sakamoto, Y., Tanaka, N., and Ogasawara, W.
  • Organizer: 6th International GIGAKU conference in Nagaoka
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of Substrate Recognition Residues in Family S46 Peptidase from Gram-Negative Bacteria (2017)
  • Author(s): Nakamura, A., Ito, Y., Suzuki, Y., Roppongi, S., Hidaka, K., Sakamoto, Y., Tanaka, N., and Ogasawara, W.
  • Organizer: 2017 2nd STI-Gigaku
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of dipeptidic inhibitors targeting DPP7 derived from multiple drug resistant bacteria Stenotrophomonas maltophilia (2017)
  • Author(s): Yuki Sakurai, Koushi Hidaka, Anna Miyazaki, Keiko Hojo, Saori Roppongi, Yasumitsu Sakamoto, Yasuhiro Ito, Yoshiyuki Suzuki, Wataru Ogasawara, Nobutada Tanaka, and Yuko Tsuda
  • Organizer: The 54th Japanese Peptide Symposium
  • Int'l Joint Research