2016 Fiscal Year Annual Research Report
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16H04907
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
上口 美弥子 (田中美弥子) 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 准教授 (70377795)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 新規調整剤 / 阻害剤 / ジベレリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物ホルモンのひとつであるジベレリン(GA) は、草丈の伸長促進や発芽促進、花芽形成促進などさまざまな生理作用をもつ。 GA生合成経路の後半段階においてはGA20-oxidase (GA20ox)およびGA3-oxidase (GA3ox)が、代謝経路ではGA2-oxidase (GA2ox)が働いており、いずれも2-オキソグルタル酸(2OG)要求性酸化酵素に属する酵素である。 これら酵素群の阻害剤として植物成長調整剤であるプロヘキサジオン (PHX) が知られており、生産性を上げることを目的に広く利用されている。しかしながら、本植調剤は、GA生合成酵素だけでなく、代謝酵素も同時に阻害するため、矮化剤として更なる改良が望まれる。
そこで申請者は構造学に基づいた新規調整剤や進化型の酵素の作製を目的に、構造が明らかとなっていないイネGA2ox3ならびにGA3ox2とPHXおよび基質GAとの共結晶化を試みた。 現在GA2ox3については、植調剤PHX存在下で得られた結晶を放射光施設SPring-8にて測定し、2.9オングストロームの反射を得ている。 まだ構造解析には至っていないが、PHXが2OGの結合場所に結合していたことから、2OGと拮抗的に働きGA2ox3を阻害していることが示唆された。
さらに、GA2ox3ならびにGA3ox2と基質GAとの共結晶の構造を決定した。全体構造を比較したところGA3ox2は単量体であるのに対し、GA2ox3はS－S結合で結合したダイマー同士が相互作用した4量体を形成しており、基質であるGA4が活性中心以外にもダイマー分子の間に結合して4量体を形成していることが明らかとなった。 また、両酵素の活性中心にも大きな違いが見られ、GA3ox2の基質であるGA9はGA2ox3の基質であるGA4とは異なる位置、上下反対向きに結合していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今まで不明であったGAの生合成酵素GA3ox2のX線結晶構造解析に始めて成功した。本成果を基に、不活化酵素であるGA2ox3の構造解析結を考え合わせると、GAの生合成から代謝経路までの一連の機構解明について更なる進展が期待できる。
さらに、GA2ox3と植調剤との共結晶においては、分解能2.9オングストロームまでのデータを得ている。GA3ox2についても、基質との構造が明らかになったことにより、植調剤との共結晶化の実現性は高いと考える。
さらに、特殊な反応性を持つと考えられるGA3ox1、およびGA2ox3の植物における機能を調べるために、CRISPR/Cas9法によりノックアウト変異体を作出することができた。 また、両酵素の発現部位を調べるため、プロモーターGUSを導入した形質転換体を作出し、GA2ox3は節間伸長が起こる時期には分裂組織で分裂を制御し、その後は節で伸長を抑制している事が示唆された。
申請者らは構造解析の結果から、GA2ox3はS－S結合で結合したダイマー同士が相互作用した4量体を形成しており、基質であるGA4が活性中心以外にもダイマー分子の間に結合して4量体を形成していることが明らかにしている。ゲルろ過解析やBiFC解析により、in vitro と同様にin plantaでも多量体構造をとっており、GA4の有無により可逆的に4量体を形成することも明らかにした。さらに、各分子の酵素活性を調べたところ、GA4を介した4量体は単量体に比べ酵素反応速度がはるかに速いことが分かった。 これにより、GA2ox3は以前から知られているような遺伝子発現調節だけでなく、GA4濃度が上昇すると多量体構造を形成して活性を上げ、GA代謝を促進するといった、タンパク質レベルでの調節も行うことが示唆され、GA不活化酵素の植物内での新たな調節機構を見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度はまだ結晶化に至っていないGA3ox2と植調剤PHXとの共結晶化を進め、得られた構造から両酵素間での阻害剤との結合様式の違いを調べる。 昨年度においては、阻害剤が２つ2OGの位置にはまっていることが推定されたが、結合位置については、はっきりしなかった。そこで、さらに分解能を上げる目的で、たんぱく質の表面たんぱく質の変異を導入して、結晶化を試みる。
また、前年度に作出したGA3ox1およびGA2ox3のノックアウト変異体の形質を観察する。 観察項目としては、茎の長さ、節間長、花粉稔性、花粉管伸長等である。
さらに、予備的な実験結果としてin vitroにおけるGA3ox1およびGA3ox2の酵素活性を比較したところ、どちらの場合もGA9から本来の生成物であるGA4が生成していたが、GA7の生成も観察された。 GA7は、活性型GAであるが、唯一構造上GA2oxによる不活化を受けず、いわば最強の活性型GAと言うことができる。 このGA7が、葯で特異的に発現しているGA3ox1ではGA3ox2に比べ生成される割合が極めて高かった。 この結果を再確認および補強するため、GA3ox1のプロモーターにGA3ox2を繋いだ形質転換体イネを作出し、葯でのGA7量を定量解析する。これら形質転換体イネや変異体イネの変異形質の解析および構造解析等を通して、植物におけるそれぞれのタンパク質の構造活性相関研究を行い、新規阻害剤の開発を試みる。
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[Journal Article] Small Organ Size 1 and Small Organ Size 2/Dwarf and Low Tillering form a Complex to Integrate Auxin and Brassinosteroid Signaling in Rice.2017
Author(s)
Hirano, K., Yoshida, H., Aya, K., Kawamura, M., Hayashi, M., Hobo, T., Sato-Izawa, K., Kitano, H., Ueguchi-Tanaka, M., Matsuoka, M.
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Journal Title
Molecular plant
Volume: 10
Pages: 590-604
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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