2016 Fiscal Year Annual Research Report
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16H04908
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
吉村 徹 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (70182821)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / D-セリン / D-アスパラギン酸 / セリンラセマーゼ / 腎障害マーカー / 細胞性粘菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物型セリンラセマーゼ(SerR)は Serのラセミ化とともに、デヒドレーション反応も触媒するがD- Serに対する活性はL -体に対して顕著に低い。重水中でのセリンデヒドレーション反応やトレオニンエナンチオマー分解反応の動力学的解析によって、活性中心における基質OH基の配向の差異がこの原因であると推測した。
哺乳動物におけるD-Asp生合成へのSerRの関与を検証するため、PC12細胞にSerRを大量発現させたところ、培地中のD- Asp濃度が上昇した。一方、SerR遺伝子をノックアウトした場合は、D-Ser 濃度は低下したが D-Asp 濃度は変化しなかった。同遺伝子をノックアウトしたマウス個体では前頭皮質と海馬でのD-Asp 濃度が減少したが、大脳と睾丸では変化がなかった。この結果、Ser Rは D-Asp生合成に関与するものの、別のD-Asp生合成系が存在することが示唆された。
健常者の尿中 D-Ser濃度とクレアチニン濃度の比がほぼ一定であることを見出した。一方、アテローム性動脈硬化など腎障害のリスクファクターを有する被験者では、 尿中D-Ser濃度は尿中 L-SerよりもeGFRに対する良い相関を示すことを明らかにした。これに対して、尿中のD-およびL-Ser濃度とL-FABPや NAGとの相関は認められなかった。
D-Serと発生の関係を検討するため、細胞性粘菌、Dictyostelium discoideum においてD-Ser 分解を担う D-serine dehydratase (DSD) 遺伝子をノックアウトした。この結果、多細胞期での生育遅延が見られ、菌の生育はearly culmination stageで著しく停滞した。qRT-PCR 解析の結果、cAMP シグナル伝達に異常が起こることが認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請書に記載した４項目の研究計画のうち、３項目については順調に進行し、一定の結論を得ることができた。このうち1件については論文として報告、１件はを投稿中であり、もう1件は論文作成中である。当初の研究計画にある残りの１項目、D-Aspによる培養細胞の抗酸化性の増強については、培養細胞を用いて検討を行い、 D-Aspによる Nrf2の転写を促進を示唆するデータが得られたが、このデータの再現性が認められなかったため断念した。以上の状況を鑑みて、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
真核生物型セリンラセマーゼの反応機構について今回得られた「活性中心における基質OH基の配向の差が D-SerとL-Serのデヒドレーション反応の効率に影響する」という考察を検証するため、 それぞれのエナンチオマーを基質とした場合の反応中間体アナログと酵素の複合体の結晶構造解析を行う。具体的には基質との分子外シッフ塩基アナログであるピリドキシル-D- および L-セリンと酵素の複合体の結晶構造解析を進める。
今回の研究の結果、哺乳動物のD-Aspの生合成にセリンラセマーゼが関与する一方、未知の D-Asp生合成系の存在が示唆された。この未知の系を明らかにするため、D-アミノ酸生合成酵素遺伝子をファンクショナルクローニングによって得る系を考案する。まずE. coli の生育に必須な D-Alaと D-Gluの生合成酵素であるアラニンラセマーゼとグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を破壊した E.coli株を作成する。D-Alaおよび D-Gluの要求株であるこの変異株に、各種D-アミノ酸とケト酸の間のアミノ基転移を触媒する D-アミノ酸トランスアミナーゼ遺伝子を導入する。この結果得られた E. coli株は、菌体内で何らかの D-アミノ酸が生成した場合には、それぞれピルビン酸と2-オキソグルタル酸から D-Alaと D-Gluを生合成することが可能となり、両D-アミノ酸の要求性が解除される。すなわち、この株でD-Asp生合成酵素が発現すれば、菌はD-Alaおよび D-Gluを含まない培地に生育が可能となり、同酵素遺伝子が取得できるというものである。この系はD-Aspに限らず、様々な D-アミノ酸生合成酵素遺伝子のスクリーニングに応用可能である。
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