2016 Fiscal Year Annual Research Report
Functional analysis of food proteins and food-related enzymes.
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16H04909
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三上 文三 京都大学, 農学研究科, 教授 (40135611)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 食糧関連酵素の構造生物学 / 食糧関連酵素のタンパク質工学 / アミラーゼ / トランスグルタミナーゼ / 食糧関連酵素のＸ線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の機能はタンパク質の構造変化によって発揮される。食糧関連酵素・タンパク質の構造変化と機能との関連を明らかにするために、凍結法と非凍結法を駆使して複合体の様々な構造を明らかにし、得られた成果を新機能設計を行うことを目的とした。
１．β‐アミラーゼの反応機構の解析 ダイズβ‐アミラーゼの結晶についてはキャピラリー結晶を用いて構造のｐH依存性を野生型とT342V変異体についてpH3から9の間で調べた結果、活性部位の‐1サイトに結合するグルコース残基の構造が、低いpHではイス型であるのに対して、pHが上昇するとαアノマーのボート型に変化することが明らかになった。野生型酵素の場合、この変化の見かけのpKaの値は4.5付近であるのに対して、T342V変異体では8.2付近に上昇していた。この結果は、触媒反応を進行するためには‐1サイトのグルコース残基が歪むことが必要であり、その構造変化にT342が関わっていることを示している。
２．プロテイングルタミナーゼ（PG） PGについては、活性ポケット入口の残基が本酵素の生成物選択性を決定し、その変更により逆反応を触媒する酵素の設計が可能になると考えられ、D154NとD154K変異体の作製と、そのＸ線結晶構造解析を行った。
３．トランスグルタミナーゼ（MTG） MTGの中間型およびプロ型の構造解析の結果から、プロ領域のへリックス構造が活性部位のクレフトにはまり込こむことによってプロ体が不活性になっていることが示されている。この阻害へリックスを含む24残基のペプチドを合成して成熟型MTGとの複合体を形成し、そのＸ線結晶構造解析を行った結果、ペプチド部分がプロ領域と同様の構造をとっていることが判明した。
４．アルカリ処理によるタンパク質の安定化 カーボニックアンヒドラーゼをアルカリ処理することで熱安性が増加することを変性解析により確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．β‐アミラーゼの反応機構の解析 β‐アミラーゼの活性部位には、二つの可動ループ（フレキシブルループとインナーループ）と側鎖の構造変化をおこすLys295の側鎖が存在する。これらの可動部位の変異体とマルトースとの複合体の構造解析を凍結法を用いて行い、それぞれの構造変化のマルトース濃度依存性を明らかにした。更に、構造のpH依存性について検討したが、凍結法ではpHの再現性が得られず、キャピラリー法を用いて非凍結状態で実験した結果、‐1サイトに結合するグルコース残基の構造が、低いpHではイス型であるのに対して、pHが上昇するとαアノマーのボート型に変化することが明らかになった。野生型酵素の場合、この変化の見かけのpKaの値は4.5付近であるのに対して、T342V変異体では8.2付近に上昇していた。現在、Lys295の変異体であるK295Aを用いて同様の実験を行っている。
２．プロテイングルタミナーゼ（PG） PGについては、活性ポケット入口周辺の残基が本酵素の生成物選択性を決定し、その変更により逆反応を触媒する酵素の設計が可能になると考えられ、D154NとD154K変異体の作製と、そのＸ線結晶構造解析を行い、現在、機能解析を行っている。
３．トランスグルタミナーゼ（MTG）プロ領域の24残基のペプチドを合成して成熟型MTGとの複合体を形成し、そのＸ線結晶構造解析を行った結果、ペプチド部分がプロ領域と同様の構造をとっていることが明らかになった。現在、より短いペプチドを合成し、その阻害活性と複合体のＸ線結晶構造解析を行っている。
４．アルカリ処理によるタンパク質の安定化 カーボニックアンヒドラーゼをアルカリ処理することで熱安性が増加することを変性解析により確認した。現在、このアルカリ処理カーボニックアンヒドラーゼの結晶化とＸ線結晶構造解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．β‐アミラーゼの反応機構の解析 凍結法とキャピラリー法を用いて種々の変異体とマルトースとの複合体のマルトース濃度依存性と複合体構造のpH依存性について検討してきた。しかし、マルトースは本酵素の生成物であり、本来の基質とは異なっている。そこで、本酵素の触媒残基であるGlu186（酸触媒）とGlu380（塩基触媒）の変異体（E186AとE380A）と本酵素の基質であるマルトペンタオース（G5）との複合体のG5濃度依存性と複合体構造のpH依存性について検討する。
２．プロテイングルタミナーゼ（PG） PGについては、活性ポケット入口周辺の残基が本酵素の生成物選択性を決定し、その変更により逆反応を触媒する酵素の設計が可能になると考えられ、D154NとD154K変異体の作製と、そのＸ線結晶構造解析を行った。今後は、活性ポケット入口周辺のSer195、Ser289、Tyr196の変異体について検討する。
３．トランスグルタミナーゼ（MTG）プロ領域の24残基のペプチドを合成して成熟型MTGとの複合体を形成し、そのＸ線結晶構造解析を行った結果、ペプチド部分がプロ領域と同様の構造をとっていることが明らかになった。より短いペプチド（20残基、15残基、10残基）を合成し、その阻害活性と複合体のＸ線結晶構造解析を行う。
４．アルカリ処理によるタンパク質の安定化 カーボニックアンヒドラーゼ以外に構造が既知で、主鎖の二面角が左巻きのヘリックス領域にあるタンパク質を選び、そのアルカリ処理による熱安定化と、Ｘ線結晶構造解析について検討する。
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