2017 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子ノックアウト/インによる魚類精子形成のコントロール
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16H04965
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤本 貴史 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (10400003)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山羽 悦郎 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (60191376)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 遺伝・育種 / ゲノム編集 / 不妊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
トランスクリプトーム解析によりスクリーニングされた性転換クローンドジョウ雄の精子が低運動性となる候補遺伝子（以下、遺伝子X）の発現組織について調査したところ、野生型ドジョウでは精巣で特異的に高発現することが明らかとなった。クローンドジョウの精巣における遺伝子発現解析を行ったところ、野生型と同様の発現量を示したため、遺伝子Xはクローンドジョウにおいて精子の運動性を低下させる原因遺伝子ではないことが示唆された。
ゲノム編集を用いた遺伝子Xのノックアウトによる不妊化技術では、ドジョウにおいて成熟したF0個体の雄が成熟に至った。F0雄の産した精子において変異導入が確認された。しかしながら、それらは正常な運動率を示し、野生型雌との人工交配では変異をヘテロでもつF1個体が50％の変異伝達率で誘起できたことから、受精能を持つことが明らかとなった。変異へテロの個体を用いたシーケンス解析より、7塩基あるいは8塩基の欠失が生じており、演繹アミノ酸配列には終止コドンの形成が確認された。このことより、変異導入されたゲノムからは正常な翻訳産物が形成されないことが期待される。ゼブラフィッシュにおいても遺伝子Xのノックアウト個体の誘起をおこなっており、変異導入が確認されたF0個体の誘起に至った。
哺乳類で報告されている精子形成関連遺伝子（以下、遺伝子Y）のガイドRNAをドジョウとゼブラフィッシュにおいて設計し、変異が導入されたF0世代の作出に成功した。また、発現解析より遺伝子Yは生殖腺に限らず、ほぼ全ての組織で発現していることが明らかとなった。ゼブラフィッシュでは雌雄の成熟したF0個体が得られた。F0雄の産する精子は野生型よりも低い運動率を示すとともに、精子の外部形態に異常が観察された。F0の雌雄ともに野生型との交配により子孫が得られ、変異をヘテロでもつF1の作出に至った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
野生型個体、クローン個体の精巣における遺伝子Xの発現量をリアルタイムPCRで解析した結果、クローンにおいても発現が認められたため、精子運動を低下させる原因遺伝子ではないと考えられた。そのため、A系統、B系統、クローン系統の精巣におけるトランスクリプトーム解析による原因遺伝子の探索を継続している。
精子運動に関連する遺伝子Xのゲノム編集によるノックアウト個体の誘起では、鰭のDNA解析より変異導入が確認されたドジョウのF0個体を継続して飼育した結果、F0雄の成熟個体を得ることができた。雄成熟個体が産出した精子を材料に用いてHMAにより確認した結果、生殖細胞への変異伝達を確認できた。この変異導入個体の精子をCASAによる運動性解析に供したところ、野生型個体の精子と同等の運動性を示した。さらに、受精に供した結果、変異をヘテロで持つF1世代の誘起に成功した。F1世代において導入された変異を解析したところ、7塩基あるいは8塩基の欠失が確認された。演繹アミノ酸配列では終止コドンの形成が認められ、F2世代でノックアウト個体の誘起が期待される。ゼブラフィッシュでも遺伝子Xに変異導入が確認されたF0個体の誘起に至った。
精子形成に関連する遺伝子Yのノックアウト個体の誘起では、ドジョウとゼブラフィッシュにおいて変異導入されたF0世代の作出に成功した。遺伝子Yは、ほぼ全ての組織で発現していることが明らかになったが、変異導入による初期生残への影響は見られなかった。ゼブラフィッシュではF0世代で成熟個体が得られ、変異導入個体の精子はCASAによる分析の結果、野生型よりも低い運動率を示し、外部形態にも以上が認められた。そして、F0の雌雄ともに野生型との交配により子孫が得られ、変異をヘテロでもつF1の作出に至っているため、F2世代でノックアウト個体の誘起が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
性転換クローン個体雄の精子運動低下の原因遺伝子のトランスクリプトーム解析による探索を継続して行う。候補遺伝子が見つかった場合には、野生型個体と性転換クローン雄個体の精巣における候補遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにより確認する。
精子運動に関連する遺伝子Xのゲノム編集によるノックアウト個体の誘起では、ドジョウあるいはゼブラフィッシュにおいて作出したF1個体から、変異をヘテロで持つ個体をスクリーニングし、変異へテロ個体を継続して飼育し成熟を誘起する。成熟個体が得られた場合にはF1個体間の交配によりF2個体を作出し、変異をホモでもつ個体の誘起を試みる。成熟したF1個体の雄では精子のCASAによる運動性調査と外部形態観察および、精巣の組織学的解析を行う。F2個体において変異ホモ個体を選抜し、それらの妊性や発生能力を調査するとともに、精子のCASAによる運動性や外部形態観察、精巣の組織学的解析に供し、野生型個体、F1変異へテロ個体との比較を行い、遺伝子Xノックアウトによる不妊化を評価する。
精子形成に関連する遺伝子Yのノックアウト個体の誘起では、遺伝子Xと同様に、ドジョウあるいはゼブラフィッシュにおいて作出したF1個体において変異へテロ個体をスクリーニングした後、各F1個体で導入された変異を解析し成熟まで飼育する。同一の変異が導入されたF1個体間の交配により変異をホモで持つF2個体の誘起を試みる。変異をヘテロで持つF1成熟雄とホモで持つF2成熟雄では、精子のCASAによる運動性調査と外部形態観察および、精巣の組織学的解析を行う。そして、F2個体では妊性の有無について確認し、遺伝子Yノックアウトによる不妊化を評価する。
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Research Products
(1 results)
