2016 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanism regulating expression of estrous behavior in ruminants
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16H05014
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 応用動物 / 行動学 / 獣医学 / 畜産学 / 神経科学 / ヤギ / エストロジェン / 発情行動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウシの受胎率の低下は、微弱発情や無発情などの発情行動の異常に起因する。本研究では、発情行動に第一義的役割を果たすエストロジェン（E）の受容体（ER）発現をコンディショナルにノックアウトできる遺伝子改変ヤギを、ゲノム編集技術とアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを活用して作出する。この動物をモデルとして用いて、発情行動の変化を調べ、反芻家畜の発情行動を制御する神経機構の局在を同定し、その分子メカニズムを解明することを目的とする。
本年度は、発情行動を任意のタイミングで誘起するため、卵巣除去シバヤギにプロジェステロンおよびEを処置して発情行動を誘起するモデルを構築し、発情行動特異的な指標（行動量、鳴き、交尾行動など）の定量と、血中性腺刺激ホルモン濃度の測定を行った。行動量（歩数）の増加が黄体形成ホルモンサージに先行して起こり、この時間的相関関係はオスに対する受容行動を示さない無発情個体においても顕著であったことから、発情に伴う行動量の増加は発情行動を評価する定量的指標となることが明らかとなった。
また、ゲノム編集技術を用いて、ヤギER遺伝子（ESR1）座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ（ESR1-floxedヤギ）を作出することを目的として、ヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子の探索を行い、ヤギESR1のゲノム構造を明らかにすることを試みた。現在、シバヤギのゲノムDNAサンプルを用いて、ゲノムウォーキング法によりヤギESR1上流域の解析を実施している。
さらに、AAVベクターを用いた遺伝子改変技術に適用するため、ヤギ脳内局所にAAV-Creを投与する手法の開発を行った。脳定位固定装置と脳室のX線造影画像を用いて、ERが発現する領域に微量投与用カニューレを留置する手法の開発と、ヤギ脳組織への感染に最適なAAV血清型の探索を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画では、まず、発情行動誘起モデルの構築と発情行動の定量化を行うことを目的としていた。卵巣除去シバヤギを用いて、プロジェステロンおよびEの投与により発情行動を誘起する条件設定を行い、発情行動誘起プログラムの最適化によりモデル実験系の構築が完了した。このモデルを用い、発情行動特異的なパラメーター（行動量、鳴き、尾振り、交尾行動など）の定量と、その背景となる神経内分泌指標（血中性腺刺激ホルモン濃度、性ステロイドホルモン濃度など）の経時変化を調べたところ、発情に伴う行動量の増加が発情行動を評価する定量的指標となることを明らかにできた。
また、本年度はヤギ胎仔繊維芽細胞を用いてTALEN法またはCRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用し、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立することを予定していた。現在のところ、ヤギESR1のゲノム構造情報を取得するのに時間を要していることから、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立には至っていない。次年度は、本年度に引き続いてESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立をめざす。さらに、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定まで到達できなかったが、他の遺伝子導入に際して導入効率が良いことを確認している血清型（AAV-1、AAV-5、AAV-DJなど）の情報を活用し、次年度には同定をめざす予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、ゲノム編集技術によりヤギESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系を樹立したのちに、体細胞クローン技術を利用してESR1遺伝子座にloxP配列を導入したESR1-floxedヤギを作出し、さらにCre/loxPシステムによりコンディショナルにESR1をノックアウトして反芻家畜の発情行動を制御する神経機構の局在を解明することをめざしている。それぞれの技術をヤギに適用する手法は確立されつつあり、本年度確立した発情に伴う行動量増加を指標とした発情行動の定量的評価系と組み合わせて、発情行動を制御する神経機構の解明に全力をあげる。また、ヤギを用いた発情行動の定量的評価系とc-fosなどの最初期遺伝子発現の組織学的検索とを組み合わせて実施する実験に新たに取り組み、反芻動物の発情行動を制御する神経機構の局在解析を加速化させる。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Immunohistochemical characterization of the arcuate kisspeptin/neurokinin B/dynorphin (KNDy) and preoptic kisspeptin neuronal populations in the hypothalamus during the estrous cycle in heifers.2016
Author(s)
Hassaneen, A.S.A., Naniwa, Y., Suetomi, Y., Matsuyama, S., Kimura, K., Ieda, N., Inoue, N., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K.-I., Matsuda, F. and Ohkura, S.
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Journal Title
Journal of Reproduction and Development
Volume: 62
Pages: 471-477
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Molecular and epigenetic mechanism regulating hypothalamic Kiss1 gene expression in mammals.2016
Author(s)
Uenoyama, Y., Tomikawa, J., Inoue, N., Goto, T., Minabe, S., Ieda, N., Nakamura, S., Watanabe, Y., Ikegami, K., Matsuda, F., Ohkura, S., Maeda, K.-I. and Tsukamura, H.
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Journal Title
Neuroendocrinology
Volume: 103
Pages: 640-649
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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