2018 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular analysis of small nucleic acid molecules for the development of novel diagnostic methods of canine leishmaniasis
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16H05023
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
片倉 賢 北海道大学, 獣医学研究院, 特任教授 (10130155)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 人獣共通感染症 / 犬リーシュマニア症 / エキソソームRNA / 早期血清診断法 / 次世代診断法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
内臓型リーシュマニア症ではヒトもイヌも不顕性感染が多い。早期診断が臨床的にも疫学的にも重要であるが、既存の診断ツールの感度は不十分である。そこで本研究では、新規のリコンビナント蛋白質を抗原とする免疫血清診断法を確立し、早期診断の有用性を検証すること、および、血中に出現する低分子量の核酸分子をバイオマーカーとするより感度と特異性の高い次世代型のリーシュマニア症診断法を開発するための道筋をつけることを目的とした。
平成30年度は、SDS-PAGEから候補抗原分子を切り出して、質量分析(LC-MS/MS)を行った。得られたデータをMASCOTプログラムで解析したところ、ペプチド情報から得られたタンパク質はGP63、heat shock protein 70 (HSP70)、HSP83、mitochondrial chaperonin HSP60、tubulin beta chainであった。もっともスコアの高い分子はHSP70であったため、1962塩基長のLeishmania donovaniのHSP70遺伝子を増幅し、pET30aベクターに挿入した。大腸菌で発現させたのち、ニッケルカラムで精製し、リコンビナント蛋白質を得た。これを抗原として、ウエスタンブロッティングを実施した。その結果、本リコンビナント抗原は陽性コントロールとして反応させたイヌ・リーシュマニア症の臨床例の血清とは強く反応したが、これまでの解析方法では、イヌ・リーシュマニア症の早期診断に有用であるとの結論を得るには至らなかった。
一方、リーシュマニアのセルフリーDNAが検出されたバングラデシュの野犬の血漿を対象にして、リーシュマニア由来samll RNAの存在の有無について次世代シーケンス解析を試みた。しかし、用いた分析方法では十分な解析結果を得ることができず、さらなる検討の必要性が示された
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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