TRIM-SUMO-11S proteasome pathway: a possible axis for ubiquitylation-independent endoplasmic reticulum-associated degradation of AE1 mutants

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05031
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 稲葉 睦 北海道大学, 獣医学研究科, 教授 (00183179)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山崎 淳平 北海道大学, 獣医学研究科, 助教 (20732902)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 膜蛋白質 / 小胞体関連分解 / プロテアソーム / 疾患

Outline of Annual Research Achievements

小胞体(ER)で合成された膜内在性蛋白質のユビキチン(Ub)非依存性の品質管理(ERQC)とプロテアソーム系蛋白質分解(ERAD)の仕組みは未だに謎である。本研究では、AE1アニオン交換輸送体変異体R664X AE1のUb非依存性ERQC/ERADについて、TRIM蛋白質／SUMO蛋白質が関与する分解機構の仮説を検証することを目的とする。平成２８年度は、R664X AE1との相互作用が示唆されるTRIM28に加え、ERへの分布やERADとの関連が知られるTRIM13、TRIM59、TRIM21について、HEK293細胞に一過性発現させたR664X AE1に対する影響、相互作用を検討した。
R664X AE1含量は、TRIM13の共存下で有意に減少（49％±6％）、TRIM21、TRIM59の共存で有意に増加（各160％±17％、316％±63％）した。TRIM28には明確な影響が認められなかった。一方、Ub依存性ERADで分解されるCFTRは、TRIM59共存下で175%±15％に増加したが、他のTRIMによる量的変動は認められなかった。また、HEK293細胞に発現させたこれらのTRIMSはERへの分布を示すが、同じくERに分布するR664X AE1と共発現させると両者の共在は見られず、免疫沈降反応によるR664X AE1との結合も認められなかった。
一方、CLPTM1は一過性発現でR664X AE1含量を約300％に増加させ、siRNAによる発現抑制では約35％に減少させた。また、CLPTM1はR664X AE1と結合を示す一方で、CFTRとの結合は認められなかった。
これらの知見は、CLPTM1、TRIM13、TRIM59などが、Ub非依存性ERQC/ERADでERシャペロン分子として機能する可能性を示す新規知見であり、その全貌を解明する端緒となる知見である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画では、既にERADに関与することが知られているTRIM21、Ub/SUMOリガーゼとして知られるTRIM28のR664X AE1分解への関与、またSUMO化による品質管理を仮説に、その検証を行った。しかし、HEK293細胞系での実験結果は、これらの分子の役割は否定的であり、むしろ機能が未知であるTRIM13、TRIM59、ならびにCLPTM1の影響、あるいはR664X AE1との相互作用を示唆する知見が得られた。一方、想定したSUMO化についても現在のところ否定的な結果が得られており、これについては今後確認を行う。
仮説とは異なる結果が得られているが、R664X AE1のERQC/ERADに関与するいくつかの蛋白質候補を見出せ、その仕組みの具体解明に向けた次の段階への基本的な準備が行えたことから、上記のとおり判定した。

Strategy for Future Research Activity

１．SUMO化の検証：初年度の結果に基づき、まず、Ub非依存性ERADを受けるR664X AE1がSUMO化にも非依存性であることを明確に示す。これによりTRIM分子群の絞り込み（TRIM21、TRIM28を検討対象から除外）を行う。
２．CLPTM1の機能：膜内在性蛋白質のERQC/ERADにおけるCLPTM1の機能について、CLPTM1とR664X（ならびにWT）AE1の相互作用の特異性、生体組織・細胞のERQC/ERADにおける役割の可能性の検証、TRIM蛋白質との関連を含め、どのような相互作用で認識とプロテアソーム分解が行われるのか、その仕組みを明らかにする。
３．認識と分解の場の解明：従来知られる膜内在性蛋白質のERQC/ERADと異なり、ER膜上で生じることが、このUb/SUMO非依存性分解の大きな特徴である。これを立証することは容易ではないが、Ub依存性の対照として用いるCFTRがAE1との相互作用によってR664X AE1が共存する場合には、その分解を細胞質で行わせるようになる知見(Adachi et al., 2010)を利用した実験系、あるいは、ER膜、プロテアソーム系の試験管内実験系を考案、工夫して検証にあたる。