新規2型糖尿病マウスの膵臓β-細胞喪失に関わる責任遺伝子の同定と病態解析

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05048
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 須藤 淳一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主席研究員 (60355740)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小島 美咲 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 主席研究員 (80355742)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 2型糖尿病 / インスリン低下 / β細胞喪失 / QTL / コンジェニックマウス

Outline of Annual Research Achievements

インスリン低下型の糖尿病表現型を示すことが予想されたコンジェニックマウスが正常であったことから、DDD系統由来のより動原体に近い染色体領域を保有するコンジェニックマウスを数系統樹立するため、8世代の戻し交配が完了した。一方、4世代の戻し交配が完了した時点で、第4染色体のほぼ全域をDDD系統でホモに置換したコンジェニックマウスも樹立した。
昨年度の研究結果に基づき、低インスリン値を示すF2-Ayマウスのうち、本来発症しないはずのB6/B6およびDDD/B6の個体がかなり含まれていたことから、第4以外の染色体にも責任遺伝子が存在する可能性を調査した。すなわち、48匹の低インスリン値を示したF2-Ayマウスについて、ゲノムワイドにマーカーをジェノタイピングし、DDDおよびB6アリルの頻度が著しく期待値と異なる遺伝子座を探索した。しかしながら、そのような遺伝子座は同定されなかった。そこで、全F2-Ayマウスをジェノタイピングし、第4染色体QTLと相互作用する遺伝子座、あるいは第4染色体QTLと関係なく、インスリン低下型糖尿病表現型を生じる遺伝子座を探索することにし、ジェノタイピングを開始した。第4染色体QTL以外のQTLの存在の可能性は十分に考えられる。なぜなら、当初第4染色体QTLを同定した時の遺伝交配はDDD×(B6×DDD.Cg-Ay) F1-Ay であり、DDD由来の優性遺伝子は原理的に同定不可能であったためである。一方、上述の48匹のF2-Ayマウスに加えて、合計100匹程度のF2-Ayマウスについて抗インスリン抗体を用いた免疫染色標本を作製した。この結果に基づく質的マッピングを開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①第4染色体のより近位部を保有するコンジェニック系統を育成した（現在N8世代）。これらコンジェニックのうちには、わずかな染色体領域のみを導入されたものも獲得できた。また、4世代の戻し交配が完了した時点で、第4染色体のほぼ全域をDDD系統でホモに置換したコンジェニックマウスも樹立したが、生後15週齢に至るまで、重篤な病態は確認されていない。コンジェニックについてはもう少し観察を続ける。②一方、低インスリン値を示すF2-Ayマウスのうち、本来発症しないはずのB6/B6およびDDD/B6の個体がかなり含まれていたことから、第4以外の染色体にも責任遺伝子が存在する可能性が示唆されたが、これについて解析を行ったが、存在を示唆する結果は得られなかった。そこで、全F2-Ayマウスをジェノタイピングし、第4染色体QTLと相互作用する遺伝子座、あるいは第4染色体QTLと関係なく、インスリン低下型糖尿病表現型を生じる遺伝子座を探索することにし、ジェノタイピングを開始した。③また、上述の48匹のF2-Ayマウスに加えて、合計100匹程度のF2-Ayマウスについて抗インスリン抗体を用いた免疫染色標本を作製した。インスリン低下型糖尿病の表現型はβ細胞の減少のみならず、膵島そのものの数の減少が顕著に認められた。したがって、上述のコンジェニックの解析を含め、表現型を(1)インスリン値、(2)β細胞数、(3)膵島数の3つのカテゴリーに分け解析を実施中である。少なくとも、これら表現型に基づき、DDDマウスで実施したエキソーム解析ではQTL信頼領域に有力な候補遺伝子は同定できなかった。

Strategy for Future Research Activity

①229匹のF2-Ayマウスのジェノタイピングにより、上述した可能性、すなわち、第4染色体以外のQTLの存在の可能性、はほとんど検証できる。特に、(1)インスリン値、(2)β細胞数、(3)膵島数の3つの表現型を独立に解析し、かつ質的・量的として解析することで詳細なQTLマッピング解析を行う。30年度前半は本実験に尽力する。②糖尿病発症の前後における膵臓での遺伝子発現変化をマイクロアレイやRNA-Seqなどにより解析する。既に、生後の25週齢に至るまでのDDD.Cg-Ayマウスの詳細な表現型解析を終えており、およそ14週齢時に至れば重篤な糖尿病表現型が観察できることが明らかとなっており、30年度中に解析を完了する予定である。エキソーム解析、あるいは他のバイオインフォマティックス解析の結果などと共に、遺伝子変異を同定する。29年度の結果から、エキソーム解析では有効な候補遺伝子が同定されなかったことから、膵臓において、糖尿病病態の発症に伴って有意に発現変化する遺伝子を同定しようとする試みは非常に有望である。③群飼育および単独飼育のDDD.Cg-AyおよびDDDマウスの雌雄について、生後の25週齢時まで、表現型解析を終えた。飼育条件の影響、病態の雌雄差は歴然としているので、これらの形質について、生理学的な意義を与える。飼育条件の影響、病態の雌雄差に関しては、精巣摘出マウスなどを用いた実験を試みたが、もともとのDDD.Cg-Ayマウスの離乳時体重にばらつきがあり、きちんとしたデータが得られなかった。この点（特に分娩させる環境）について、改善を加える必要がある。