2016 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive analysis of the regulation of stress responses by the modulation of NADH metabolism in plants
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16H05070
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
重岡 成 近畿大学, 農学部, 教授 (80140341)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 和也 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (90379561)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ストレス応答 / レドックス制御 / Nudix hydrolase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物におけるNADH代謝調節によるストレス応答制御の包括的解明を目指して、NADH加水分解酵素であるシロイヌナズナNudix hydrolase, AtNUDX6および7による生物的および非生物的ストレス応答の制御機構を明らかにすることを試みた。
1) AtNUDX6および7の一過的誘導発現のストレス応答への影響：AtNUDX6および7のシロイヌナズナ遺伝子破壊株 (KO-nudx6および7) に両酵素の活性型もしくは不活性型を一過的に発現誘導した結果から、PAR反応の制御には細胞内NADH量の調節が重要であること、NPR1依存的な生物的ストレス応答の制御には細胞内NADH量ではなくAtNUDX6および7自身の存在もしくは他の因子との相互作用が重要であることが示唆された。
2) AtNUDX6および7の発現解析：GUS遺伝子を用いた発現解析の結果、AtNUDX6はロゼッタ葉とカーリン葉の先端や花芽の苞片全体に、AtNUDX7は、ロゼッタ葉とカーリン葉、基部、花芽、根、長角果など広範囲の組織で発現していることが明らかとなった。
3) 細胞内NADHレベル変化により発現制御される遺伝子群の機能解析：細胞内NADHレベルと正もしくは負に相関して発現量が変化する遺伝子の中から、12種の遺伝子に対する13株の遺伝子破壊株の発現解析の結果、3株のT2世代において転写が完全に抑制、5株において転写が一部抑制、2株において過剰発現していることを確認した。
4) AtNUDX6および7の相互作用因子の同定：AtNUDX6の一過的発現に伴いSAシグナル経路関連遺伝子の発現変動が認められた株から調製したcDNAライブラリーを用いて酵母ツーハイブリッド法を行った。その結果、AtNUDX6の相互作用候補因子として低分子量GTPaseタンパク質ファミリーの一つ（RGP1）を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では植物におけるNADH代謝調節によるストレス応答制御の包括的解明を目指して、1) AtNUDX6および7の一過的誘導発現のストレス応答への影響、2) AtNUDX6および7の発現解析、3) 細胞内NADHレベル変化により発現制御される遺伝子群の機能解析、4) AtNUDX6および7の相互作用因子の同定、の4つの項目について並行して解析を進めており、それぞれから得られた成果や確立した実験手法を互いに活かすことで、相乗的に進展させることができた。これらの成果は、ほぼ当初の計画通りであり、事実、本研究により得られた成果により多数の学会発表を行い、複数の査読付き雑誌に掲載されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
概ね研究実施計画に従い、以下に示すように推進する。
1) AtNUDX6および7の一過的誘導発現のストレス応答への影響：前年度に行った、AtNUDX6および7のエストロゲン(ES)による一過的誘導発現株における細胞内NADHレベルの変化もしくは両酵素自身の存在量の変化が、生物的および非生物的ストレスに対する応答に及ぼす影響を検証するために、NADHの前駆体であるキノリン酸添加によるNADHレベルの増加が上述の生物的および非生物的ストレスに対する耐性能やPAR反応などに及ぼす影響を検討する。
2) AtNUDX6および7の発現解析：AtNUDX6および7のプロモーターとルシフェラーゼ(LUC)遺伝子を連結したコンストラクトを導入したシロイヌナズナ植物体を用いて、両酵素遺伝子の空間的な発現制御、すなわちシグナルの組織間での伝達の可能性を考慮して、局所的なストレス付与が他所での発現に及ぼす影響を検討する。
3) 細胞内NADHレベル変化により発現制御される遺伝子群の機能解析：発現レベルが細胞内NADHレベル変化と正および負の相関関係を示した遺伝子(NADH-responsive gene, NRG)の遺伝子破壊株を用いて、種々のストレス条件に対する耐性能や応答性の変化を解析する。
4) AtNUDX6および7の相互作用因子の同定：酵母ツーハイブリッドシステムを用いて前年度までに同定した、AtNUDX6の相互作用因子について、遺伝子破壊株を用いて機能解析を行う。また、AtNUDX7の相互作用因子の選抜を継続する。
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