2016 Fiscal Year Annual Research Report
アレルゲン親和性によるIgE受容体動的多様性とシグナルエディティングの分子基盤
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16H05082
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鈴木 亮 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 講師 (00344458)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アレルギー / マスト細胞 / アレルゲン / 親和性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アレルゲン（抗原）と特異的IgEのアフィニティーが、IgE受容体活性化の多様性を制御していることが申請者の研究から明らかになっている。本研究は、アフィニティー特異的なシグナル伝達のエディティング機構を明らかにし、複雑なアレルギー反応の実体を解明しようとするものである。具体的には以下の項目について追究した。（１）はじめにアレルゲン親和性による転写制御機構を追究することを試みた。その手段として、マスト細胞株（RBL-2H3細胞）にNF-AT（Nuclear Factor of Activated T-cells）・ルシフェラーゼ遺伝子を導入したRS-ATL8細胞を用い、IgEの架橋による転写制御機構を高感度に検出するIgE Crosslinking-induced Luciferase Expression（EXiLE）法を用い、親和性アレルゲンによる転写調節機構を追究した。しかしながら現在まで有効なシグナルを検出するまでには至っていない。そのため現在は、様々な転写調節因子について、リン酸化を指標に解析を行っている。（２）分泌顆粒の不均質性と親和性による炎症性メディエータ分泌制御機構を追究した。我々の研究成果から、アレルゲンの親和性が分泌するサイトカイン/ケモカインの種類や量を厳密に制御していた。そこで、ここの分泌顆粒は一様ではなく個々に異なっているのではないかと考え、単一分泌顆粒に着目し分泌制御機構の解析を行った。（３）さらに、アレルゲン親和性が、浸潤細胞の違いを誘導していたことから、両者の相互作用を分子・細胞レベルで解析凝ることが可能なin vitro共存培養系の確立を行った。その前段階としてマウス骨髄および末梢血からの好中球の単離及び培養方法の確立に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、アフィニティー特異的なシグナル伝達のエディティング機構を明らかにし、複雑なアレルギー反応の実体を解明しようとするものである。はじめに予定していたRS-ATL8細胞を用いたEXiLE法を用いて、アレルゲン親和性による転写調節機構を追究したが、アレルゲンの濃度依存性応答や親和性応答によって十分なシグナルが検出されなかった。これらの原因については現在検討を行っているところである。先述の理由から、アレルゲン親和性による転写制御機構を解明するため、様々な転写調節因子について、ウエスタンブロット法による転写調節因子のリン酸化（活性化）の解析を行っている。さらに、分泌顆粒の不均質性に関する研究では、初代培養マスト細胞やマウス皮膚組織において、サイトカインやケモカインが、別々の顆粒に独立して存在することを明らかにした。また、サイトカインやケモカインが含まれる個々の分泌顆粒には、それぞれ特異的な分泌機能蛋白質が存在していることが画像解析の結果から明らかになった。このことから個々の分泌顆粒に不均質性が存在していることが明らかになった。また、マスト細胞の親和性アレルゲンの刺激応答に伴い、親和性の違いによって選択的に誘導される浸潤細胞とマスト細胞の相互作用を追究するためin vitro共存培養系の確立を目指した。その前段階としてマウス体内より好中球の単離及び培養方法の検討を行った。そして、共存培養をするのに十分な細胞数及び純度の骨髄由来マウス好中球の単離・培養に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、昨年度得られた研究成果をさらに発展・展開するとともに、昨年度の問題点としてあった転写調節制御機構の解析においては、手法の改善や新たな研究手段によって目的の達成を目指す。またそれ以外の項目についてはさらに研究の展開を目指す。（１）我々の研究成果から、個々の分泌顆粒は個性を持ち、アレルゲン親和性などの細胞外情報を１分泌顆粒レベルで識別・認識し、サイトカイン・ケモカインを選択的に分泌制御していることが分かった。そこで、昨年度の研究で得たサイトカイン・ケモカイン含有分泌顆粒に局在する分泌機能蛋白質について、遺伝子ノックダウンシステムやゲノム編集ツールによる分泌機能蛋白質特異的ノックダウン・アウト細胞の作製とサイトカインやケモカインの刺激応答に伴う分泌の定量を行う。さらに、開口放出オプトジェネッティックセンサー（pHluorin）とサイトカインやケモカインのキメラ蛋白質を用いたイメージング解析のよる親和性依存的な顆粒トラフィッキングや膜融合システムの解明を実施するため、目的プラスミドの作成と、一分泌顆粒レベルでの分泌制御機構を明らかにする。（２）マスト細胞と親和性アレルゲン特異的浸潤細胞の相互作用が制御するアレルギー炎症修飾機構を追究するため、マスト細胞と浸潤細胞のin vitro共存培養システムを構築し、両者の相互作用について分子・細胞レベルでの相互作用を追究する。
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