2016 Fiscal Year Annual Research Report
細胞治療・バイオ創薬のための高機能分離精製技術の開発
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16H05083
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
金澤 秀子 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (10240996)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
綾野 絵理 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 研究員 (10424102)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 温度応答性高分子 / タンパク分離 / 分離精製 / バイオセパレーション / アプタマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、これまで構築した刺激応答性高分子を用いた分離デバイスを利用して、1)標的タンパクの選択的な吸脱着を可能とする機能性高分子の開発 、さらに、2)温度応答性アフィニティーシステムを構築しタンパク精製に応用した。従来法では、リガンドに結合した目的物質を溶出させる際に低pH溶媒や高塩濃度溶媒が必要となり、タンパクの凝集・変性が起こりやすい・脱塩など煩雑な後処理を要するなどの問題点がある。そこで本研究では、温度応答性高分子の温度に伴う構造変化を利用して目的物質の吸脱着を行うため従来のような低pH・高塩濃度の溶媒を用いる必要がなく、温和な条件下でのタンパク精製が可能となる。温度応答性高分子とリガンドを共固定したアフィニティー担体を作製した。
温度応答性高分子は、ある温度を境に低温側では伸長し、高温側では収縮する性質を持つ。モデルタンパクとしてトロンビン、モデルリガンドとしてトロンビンに特異的に結合するDNAアプタマーを用い、作製したアフィニティー担体の温度によるトロンビン吸脱着能を評価した。作製したアフィニティー担体において、低温では高分子鎖の伸長によりリガンドが遮蔽され、トロンビンの吸着が抑制された。高温では高分子鎖の収縮によりリガンドが表面に露出し、トロンビンが吸着された。一方、アプタマーを導入していない担体において同様の実験を行ったところ、温度に関わらずトロンビンは吸着されなかった。
また、高温でトロンビンを吸着した担体を冷却したところ、温度応答性高分子を修飾した担体ではトロンビンが脱着された。これらの結果から、本システムでは溶媒を変えることなく、温度制御のみによって目的タンパクの吸脱着を制御できる可能性が示唆された。本システムの実現によりタンパク精製における活性維持・工程簡略化に大きく貢献できると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
温度応答性高分子PNIPAAmを分離担体に応用することにより、温度変化による充填剤表面の親水性・疎水性変化を利用した吸脱着制御を、温度制御のみによって、水系溶媒中での低分子薬物と血清タンパク質の分離、及び目的タンパク質のアフィニティー精製が達成された。有機溶媒を用いない環境負荷の少ない温和な条件下で分離精製を行うため、タンパク質の活性を維持したまま効率よく精製を行うことが可能になると考えられる。以上の結果は複数の学会で発表し、研究に協力した学生が学会で受賞するなど社会的な評価も高かった。
抗体医薬品などの分離精製への応用も可能であり、実用化できる技術レベルに近づいていると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、本研究で構築した分離システムを現在実際に臨床で使用されているリツキシマブをはじめとした抗体医薬などのバイオ医薬品の精製へ応用する。
さらに細胞分離用に新たに担体及び修飾する機能性高分子を最適化するために、
充填担体の粒子径や細孔径は分離に大きく影響するため，細胞など目的物質に適した担体材料（シリカゲル，ポリマー系ゲル）について検討する。カラムサイズ及び充填方法について検討し，作製したカラムの性能（理論段数，分離係数，分離度等）について評価する。バイオプロダクツ精製への展開のためにスケールアップの際に必要な充填担体について検討する。細胞の大量培養を行い，得られた細胞抽出液から作成したアフィニティー用精製カラム（リガンドと機能性高分子を結合させた担体をカラムに充填もしくは固相分散用としたもの）を用いてリガンド結合タンパク質をアフィニティー精製する。細胞・タンパク分離の際の選択性の向上のため高機能表面を設計する。特異的なリガンドに加えて認識部位として高分子鎖中にアミノ酸誘導体を導入することにより，選択性の向上を図り，効率の良い分離システムを設計する。アイソトープラベルしたタンパクを用い回収率を求め，カラムあたりのタンパク精製量向上や，低温での結合容量を増加させる方法についても検討する。
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